靈芝蒜顆粒解酒保肝作用及機(jī)制研究.pdf

1、酒精是最常見(jiàn)的肝臟毒物之一,過(guò)量飲酒導(dǎo)致的肝臟損傷是一個(gè)世界性的醫(yī)學(xué)難題。有資料表明,成年男性每天攝入乙醇的劑量>40g,女性攝入乙醇的劑量>20-30g,就可導(dǎo)致肝臟損傷[1]。進(jìn)入體內(nèi)的乙醇,僅有2-10％通過(guò)肺臟和腎臟排出,其余大部分在肝臟中主要經(jīng)胞漿中的乙醇脫氫酶、過(guò)氧化物酶體中的過(guò)氧化氫酶以及微粒體中的乙醇氧化酶系代謝為乙醛,再經(jīng)過(guò)乙醛脫氫酶代謝為乙酸,進(jìn)入三羧酸循環(huán)代謝為二氧化碳和水。乙醇代謝過(guò)程中引起機(jī)體氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激

2、可以損傷線粒體,乙醇也可直接導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而造成線粒體功能紊亂、脂質(zhì)蓄積、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡。近年來(lái),成人酒精中毒的發(fā)生率也逐年升高；長(zhǎng)期飲酒可造成全身多系統(tǒng)的損傷、尤其對(duì)胃腸道,肝臟損傷更為明顯,酒精可直接或間接引起慢性胃炎,消化性潰瘍和酒精中毒性肝硬化。雖然近年來(lái)關(guān)于乙醇代謝的機(jī)制研究取得重大的進(jìn)展,但防治方法和治療措施并未有所進(jìn)展,人們至今尚不能有效的防治乙醇攝入導(dǎo)致的臨床問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。
　　 靈芝蒜顆粒提取物由富

3、硒靈芝提取物、大蒜提取物、麥芽糊精組成?，F(xiàn)代藥理和臨床研究證明,靈芝對(duì)多種理化及生物因素引起的肝損傷有保護(hù)作用。無(wú)論在肝臟損害發(fā)生前還是發(fā)生后,服用靈芝都可促進(jìn)肝臟對(duì)藥物、毒物的代謝,保護(hù)肝臟,減輕肝損傷,具有顯著的保肝作用[2]；硒具有強(qiáng)大的抗氧化功能,比維生素E高500倍,因此富硒靈芝的很多生物學(xué)活性要優(yōu)于普通靈芝；大蒜化學(xué)成分眾多,既是一種免疫激發(fā)劑,也是一種強(qiáng)有力的抗氧化劑。大蒜油,大蒜素,大蒜多糖等對(duì)乙醇所致的肝損傷保護(hù)作用均

4、有報(bào)道[3-4],其保護(hù)可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用等作用有關(guān)。這些報(bào)道提示了富硒靈芝、大蒜制品在對(duì)抗乙醇損傷防治中的潛在作用,根據(jù)解酒保肝產(chǎn)品的需求及現(xiàn)狀,本課題組研制出以富硒靈芝大蒜為原料配方的靈芝蒜顆粒將具有廣闊的市場(chǎng),我們通過(guò)研究靈芝蒜顆粒的保肝護(hù)肝作用,以期為其保健功能評(píng)價(jià)、開(kāi)發(fā)利用提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。
　　 目的:建立一次性乙醇攝入所致的酒精中毒模型和急性肝損傷模型,長(zhǎng)時(shí)間乙醇攝入所致的慢性肝損傷模型,通過(guò)

5、測(cè)定血清和肝臟相關(guān)指標(biāo)以及觀察組織病理學(xué)改變,評(píng)價(jià)靈芝蒜顆粒解酒保肝作用的效果及探討機(jī)制。
　　 方法:1.將40只KM小鼠隨機(jī)分成4組,每組10只,分別為對(duì)照組、LZS高、中、低劑量組,各劑量組灌胃不同濃度LZS,對(duì)照組給予生理鹽水。連續(xù)7d,最后一次灌胃后各組小鼠灌胃給予50％乙醇0.018ml/g BW,計(jì)算醉酒時(shí)間和睡眠時(shí)間:選取SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組,給藥組灌胃0.42 g/kg體質(zhì)量LZS,模型組給予生理鹽水

6、。連續(xù)7d,最后一次灌胃后,各組大鼠灌胃給予50％乙醇0.014ml/g BW,分別于灌酒后30、120、180 min自尾部采血,采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜法檢測(cè)小鼠血液中的乙醇濃度。
　　 2.將60只KM種小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,分別為正常組、模型組、LZS(高、中、低劑量)組和陽(yáng)性對(duì)照組,給藥組灌胃給予不同劑量LZS,陽(yáng)性組灌胃聯(lián)苯雙酯,模型組和正常對(duì)照組灌胃生理鹽水,連續(xù)15d,除正常對(duì)照組灌胃給予生理鹽水外,其余各組一次

7、性灌胃給予50％乙醇12ml·kg-1 BW,處死小鼠采集血液樣品和肝組織樣品。測(cè)定血清轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯(TG)及肝組織丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量,并進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。
　　 3.將75只大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,按體重隨機(jī)分組為6組,依次為正常組(n=10),模型對(duì)照組(n=13),聯(lián)苯雙酯組(n=13),低劑量組(n=13),中劑量組(n=13),高劑量組(n=13),LZS高劑量組為0.42g/kg,中

8、劑量組為0.21g/kg,低劑量組為O.11g/kg,陽(yáng)性組為0.00236 g/kg聯(lián)苯雙酯。每日上午9時(shí)給藥組灌胃給予相應(yīng)的藥物劑量,模型組和正常對(duì)照組灌胃生理鹽水,下午4時(shí)給予各組大鼠0.15ml/kg體質(zhì)量紅星二鍋頭。連續(xù)8周后,各組動(dòng)物隔夜禁食16小時(shí),處死動(dòng)物,取血清,測(cè)定血清中谷草酰胺轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、還原性谷胱甘肽

9、(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)含量；肝臟稱重,一部分肝臟10％甲醛固定,進(jìn)行肝臟病理學(xué)檢測(cè)。另稱取適量肝組織,制備10％肝組織勻漿,測(cè)定肝勻漿中利用試劑盒測(cè)定肝勻漿中丙二醛(MDA)和還原性谷胱甘肽(GSH)的含量；采用差速離心法制備肝微粒體,測(cè)定細(xì)胞色素CYP2E1、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)的活性。
　　 結(jié)果:1.小鼠睡眠實(shí)驗(yàn)表明:LZS三劑量組可不同程

10、度延長(zhǎng)小鼠醉酒時(shí)間,縮短睡眠時(shí)間。尤以高劑量為佳,與模型組相比可顯著延長(zhǎng)小鼠醉酒時(shí)間(P<0.05),縮短睡眠時(shí)間(P<0.05)；氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定大鼠酒后血中乙醇含量顯示:給藥組各時(shí)間點(diǎn)乙醇血藥濃度均小于對(duì)照組,其中120min、180 min與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.01),給藥組藥時(shí)曲線峰面積小于對(duì)照組。表明LZS具有很好的解酒作用。其機(jī)理可能通過(guò)減少乙醇的吸收.加速乙醇在體內(nèi)的代謝和排泄有關(guān)等。
　　 2.急性酒精

11、性肝損傷實(shí)驗(yàn)表明:靈芝蒜顆粒各治療組不同程度的降低小鼠血清中ALT,AST和MDA含量,升高GSH水平,其中高劑量組與模型組相比,小鼠血清ALT、TG、MDA顯著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.05),GSH含量顯著升高(P<0.01)；中劑量組與模型組相比,小鼠血清ALT含量顯著降低(P<0.05),GSH含量顯著升高(P<0.01):低劑量組與模型組相比小鼠肝勻漿GSH含量顯著升高(P<0.01)。肝臟病理組織學(xué)觀察顯示:

12、模型組肝小葉中央靜脈擴(kuò)大,肝竇淤血和出血,肝細(xì)胞明顯腫脹,彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性。陽(yáng)性對(duì)照組肝小葉的組織結(jié)構(gòu)基本接近正常,肝細(xì)胞未見(jiàn)明顯腫脹,肝細(xì)胞索排列整齊,但仍可見(jiàn)少量充血；低劑量組肝細(xì)胞腫脹,大量肝細(xì)胞脂肪變性；中劑量組中央靜脈周圍部分肝細(xì)胞脂肪變性,病變范圍變小,腫脹程度減輕；高劑量組肝小葉排列較齊,未見(jiàn)明顯的竇腔狹窄,偶見(jiàn)散在肝細(xì)胞脂肪變性。病理組織形態(tài)學(xué)觀察提示,靈芝蒜顆粒對(duì)酒精所致小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷具有一定的保護(hù)作用,尤

13、以高劑量組最佳,說(shuō)明該藥對(duì)急性酒精性肝損傷有治療作用,其對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用的機(jī)理可能是抗氧化和清除自由基。
　　 3.慢性酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)表明:大鼠攝入酒精45天后,大鼠體重顯著性降低(P<0.05),血清中AST、ALT和以及肝組織中MDA顯著增加(P<0.01)。LZS干預(yù)可顯著緩解酒精傷害,尤其高劑量組為佳,與模型組相比,大鼠體重顯著回升(P<0.01),表明高劑量組可顯著性拮抗酒精性肝損傷引起的體重降低:大鼠血清AL

14、T、AST、TG、HA、LN、TNF-α、SOD、GSH-px含量顯著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05)；大鼠血清和肝組織MDA顯著降低(P<0.01)、GSH含量顯著升高(P<0.01)；大鼠肝微粒體CYP2E1活性降低(P<0.01),GSH-px量顯著升高(P<0.01)。肝臟病理石蠟切片觀察顯示:模型組大鼠的肝組織病理?yè)p傷嚴(yán)重,肝細(xì)胞明顯腫脹,胞

15、質(zhì)疏松,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不一、數(shù)量不等的脂滴并伴有氣球樣變以及細(xì)胞水腫,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,小葉內(nèi)有點(diǎn)狀的壞死；低劑量組大鼠的肝細(xì)胞明顯腫脹,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不一,數(shù)量不等的并伴有氣球樣變以及細(xì)胞水腫,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂；中劑量組鼠的肝細(xì)胞腫脹,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量的脂滴并伴有輕微的氣球樣變,肝小葉結(jié)構(gòu)基本,完整；高劑量組；大鼠肝細(xì)胞、肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常,這表明靈芝蒜顆粒能緩解酒精傷害,可明顯減輕酒精對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝和抗氧化系統(tǒng)的不利影響。
　　

16、結(jié)論:采用睡眠試驗(yàn)、測(cè)血液中乙醇含量來(lái)研究靈芝蒜顆粒解酒效果,結(jié)果表明,LZS可不同程度的延長(zhǎng)小鼠醉酒時(shí)間,縮短睡眠時(shí)間,以高劑量為最佳:LZS可有效地降低不同時(shí)間點(diǎn)血液中的乙醇濃度,從根本上緩解急性酒精中毒的癥狀,其機(jī)制與減少乙醇的吸收/加速乙醇在體內(nèi)的代謝和排泄等有關(guān)。
　　 單次酒精灌胃造成急性酒精性肝損傷,肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加,證實(shí)氧化應(yīng)激參與了急性酒精性肝損傷,并且是一個(gè)逐漸累積的過(guò)程。此外,非酶抗氧化物

17、GSH含量、抗氧化物酶SOD活性均顯著降低,提示早期抗氧化系統(tǒng)的損傷加劇了氧化應(yīng)激。靈芝蒜顆?？梢种凭凭鸬难趸瘧?yīng)激,表現(xiàn)為顯著減輕脂質(zhì)過(guò)氧化。此外,靈芝蒜顆粒還可恢復(fù)GSH含量以及SOD的活性。因此可以推測(cè)靈芝蒜顆粒減輕急性酒精性肝損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可能與其保護(hù)抗氧化防御系統(tǒng),從而促進(jìn)ROS有效清除有關(guān)。
　　 大鼠長(zhǎng)期攝入酒精可導(dǎo)致慢性酒精性肝損傷,在肝細(xì)胞中,酒精誘導(dǎo)肝臟病理變化包括肝腫大和血清學(xué)變化,伴隨著血清中AST

18、,ALT的顯著增加。LZS能使肝指標(biāo)回復(fù)到正常水平,高劑量效果更加顯著；酒精攝入能導(dǎo)致血清和肝組織中甘油三酯水平顯著上升,LZS各組能改善不良效果,與酒精處理組比較,LZS各組能顯著降低血清和肝組織的TG水平；脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)MDA也顯著降低。LZS各組可降低MDA的合成；抗抗氧化物酶GSH-Px和SOD顯著升高,均在正常范圍；慢性肝損傷伴有部分肝纖維化出現(xiàn),LZS各組能使肝損傷模型大鼠血清HA及LN顯著降低。
　　 通過(guò)觀察靈芝