不同門脈高壓模型犬的舌下絡(luò)脈特征及其形成機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 舌診是中醫(yī)獨(dú)具特色的診法之一，為臨床診斷不可或缺的依據(jù)。舌下絡(luò)脈作為中醫(yī)舌診的重要組成部分，因其顯露易見，成為觀察人體氣血、津液盈虧和瘀血的重要指征。近年來在心血管病、消化系統(tǒng)疾病、糖尿病及惡性腫瘤等的中醫(yī)診治中得到廣泛應(yīng)用。課題組在長(zhǎng)期原發(fā)性肝癌的中西醫(yī)結(jié)合臨床中發(fā)現(xiàn)，肝癌患者多伴有舌下絡(luò)脈的擴(kuò)張、迂曲等形態(tài)及青紫、絳紫等顏色變化，這種變化非常靈敏，且多與患者的病情進(jìn)展和治療預(yù)后明顯相關(guān)。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，肝通

2、過其經(jīng)絡(luò)直接與舌相連，故肝的異常可在舌上出現(xiàn)相應(yīng)的改變。但對(duì)于異常舌下絡(luò)脈形成的分子機(jī)制，目前尚鮮有報(bào)道，對(duì)肝癌異常舌象的研究就更少之又少。既往研究認(rèn)為，異常舌下絡(luò)脈形成可能與舌的靜脈壓力升高有關(guān)，但我們工作中注意到肝癌患者伴有門靜脈壓增高者更易出現(xiàn)舌下絡(luò)脈異常，通過對(duì)肝癌患者的舌下絡(luò)脈變化與肝門脈血管及其局部血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)也證實(shí)了二者存在密切的關(guān)系。另有學(xué)者通過臨床研究證實(shí)，門脈高壓癥患者的舌下絡(luò)脈曲張率高達(dá)100％。在此基礎(chǔ)上

3、，我們提出了“舌下絡(luò)脈和肝門靜脈作為人體靜脈血管系統(tǒng)的組成部分，二者在病理上必然存在密切的內(nèi)在聯(lián)系”這一假說。而門脈高壓的形成存在肝外阻塞、肝內(nèi)阻塞和肝外肝內(nèi)復(fù)合阻塞三種類型，不同的門脈高壓形成機(jī)制是否會(huì)導(dǎo)致舌下絡(luò)脈的的不同的變化。繼續(xù)的臨床觀察注意到肝癌伴有的肝硬化病理可以引起舌下絡(luò)脈的顏色及性狀異常，而如果患者門脈高壓系繼發(fā)于門脈血管受到腫瘤侵犯之后（門脈癌栓），其舌下絡(luò)脈更具有根底部粗張迂曲、絡(luò)脈周圍瘀血細(xì)絡(luò)增多，出現(xiàn)新的小血管等

4、自身特點(diǎn)，這很難簡(jiǎn)單地用門靜脈壓力增高引起舌下絡(luò)脈被動(dòng)擴(kuò)張來完整解釋，進(jìn)一步提示不同門脈高壓的形成機(jī)制，同樣引起了舌下絡(luò)脈構(gòu)型上的多樣性。
　　 而且，引起二者舌下絡(luò)脈構(gòu)型差異的背后必然存在著并不完全一致的分子機(jī)制。
　　 成體中血管的形成主要依賴于生理性和病理性的血管生成機(jī)制，近年來許多研究也已證實(shí)，在門靜脈高壓癥過程中，肺臟和脾臟中均存在血管生成現(xiàn)象。舌下絡(luò)脈作為全身靜脈的一部分，其異常改變極可能與機(jī)體的血管生成現(xiàn)象

5、存在內(nèi)在聯(lián)系。因此我們?cè)O(shè)想根據(jù)“血管生成”理論，重點(diǎn)從血管生成的角度，探討不同門脈高壓模型異常舌下絡(luò)脈形成的可能分子機(jī)制。許多分子在血管生成中起著正向調(diào)節(jié)作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular EndotheliAlGrowth Factor，VEGF）是近年來發(fā)現(xiàn)的參與血管生成的最主要的分子。缺氧反應(yīng)、機(jī)械應(yīng)力等多種機(jī)制均可通過激活VEGF/VEGFR信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管生成。新近研究發(fā)現(xiàn)，脂肪炎癥因子及其受體Apelin/APJ通路的

6、調(diào)節(jié)與血管生成也有密切聯(lián)系，可能與VEGF/VEGFR信號(hào)通路存在“串話”并起到協(xié)同作用，可以看作是治療門脈高壓新的靶點(diǎn)。
　　 研究目的
　　 本研究通過復(fù)制肝前型、肝內(nèi)型、復(fù)合型三種門脈高壓犬模型，觀察模型犬舌下絡(luò)脈的整體和微觀變化，并從血管生成的角度，重點(diǎn)探尋VEGF/ VEGF2 型受體（vascular endotheliAlgrowth factor receptor 2, VEGFR2）及Apelin/AP

7、J信號(hào)通路與異常舌下絡(luò)脈形成之間的關(guān)系，為揭示異常舌下絡(luò)脈形成的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。
　　 研究方法
　　 （1）三種門脈高壓犬模型的制備將Beagle 犬隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和模型組。以門靜脈窄縮術(shù)復(fù)制肝前型門脈高壓模型；以二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）連續(xù)給藥誘導(dǎo)肝硬化制備肝內(nèi)型門脈高壓犬模型；以上兩種方法結(jié)合復(fù)制復(fù)合型門脈高壓模型。經(jīng)皮下留置針以生物電記錄系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)其門脈壓力

8、通過血清肝功能測(cè)定和肝臟組織病理學(xué)觀察進(jìn)行成模檢測(cè)。
　　 （2）三種門脈高壓模型犬舌下絡(luò)脈的特征觀察檢測(cè)成模后，肉眼觀察舌下絡(luò)脈形態(tài)和顏色變化；游標(biāo)卡尺測(cè)量舌底根部絡(luò)脈寬度；動(dòng)物處死后，取舌底組織，免疫組織化學(xué)顯色法檢測(cè)舌底組織毛細(xì)血管密度；
　　 透射電鏡觀察舌下絡(luò)脈的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 （3）三種門脈高壓模型犬異常舌下絡(luò)脈的形成機(jī)制研究硝酸還原酶法檢測(cè)血清一氧化氮（nitric oxide, NO）

9、濃度；Elisa 法檢測(cè)血清VEGF及其VEGFR2、缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia-induciable factor 1-α， HIF-1α）濃度；免疫組織化學(xué)顯色法和Western blot 法檢測(cè)犬舌下VEGF、VEGFR2、HIF-1α、Apelin、APJ蛋白表達(dá)；Real-time PCR 法檢測(cè)VEGF、VEGFR2、HIF-1αmRNA的表達(dá)量。
　　 結(jié)果
　　 （1）三種門脈高壓犬模型的制備與假手

10、術(shù)組比較，肝內(nèi)型組和復(fù)合型組各實(shí)驗(yàn)犬在DMN 誘導(dǎo)2周門靜脈壓力即開始升高(P<0.05)，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展模型組門靜脈壓力在4周、6周、8周呈階梯狀上升(P<0.01)，8周后肝內(nèi)型組門脈壓力持續(xù)穩(wěn)定，復(fù)合型組在進(jìn)一步行門脈窄縮術(shù)后壓力進(jìn)一步升高(P<0.01)；肝前型組在行門脈窄縮術(shù)后，門脈壓力迅速升高達(dá)峰值后逐漸下降后，處死前仍然處于較高水平(P<0.01)。另外，與正常組和假手術(shù)組比較，三個(gè)模型組實(shí)驗(yàn)犬的的肝臟組織學(xué)和（或）肝功能出現(xiàn)

11、不同程度的異常改變，顯示模型復(fù)制成功。
　　 （2）三種門脈高壓模型犬舌下絡(luò)脈的特征觀察肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)型門脈高壓組和復(fù)合型組模型犬舌下絡(luò)脈形態(tài)較正常組和假手術(shù)組迂曲粗大，血管周圍出現(xiàn)瘀點(diǎn)和細(xì)絡(luò)，顏色變暗變紫，舌根部絡(luò)脈直徑明顯增粗(P<0.01)，肝前型門脈高壓組犬僅絡(luò)脈顏色變暗，舌根部絡(luò)脈直徑增粗不明顯；與正常組和假手術(shù)組比較，免疫組化結(jié)果顯示三個(gè)模型組實(shí)驗(yàn)犬舌底CD31表達(dá)均顯著增加(P<0.01)，以復(fù)合型組增加最為明

12、顯；透射電鏡顯示，三個(gè)模型組實(shí)驗(yàn)犬血管壁全部或局部增厚，管腔變小，出現(xiàn)新的毛細(xì)血管，內(nèi)皮細(xì)胞膜界限不清，細(xì)胞核損失甚或消失，復(fù)合型組改變程度最重，肝內(nèi)組次之，肝前型組改變較小。
　　 （3）三種門脈高壓模型犬異常舌下絡(luò)脈的形成機(jī)制研究與正常組和假手術(shù)組比較，三種模型組實(shí)驗(yàn)犬血清NO濃度明顯升高(P<0.01)；
　　 肝內(nèi)型組和復(fù)合型組血清VEGF、HIF-1α濃度明顯升高(P<0.01)，肝前型組升高不明顯；三種模型組

13、實(shí)驗(yàn)犬舌底組織VEGF、VEGFR2、HIF-1α蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，趨勢(shì)為復(fù)合型組>肝內(nèi)型組>肝前型組；舌底組織VEGF、VEGFR2、HIF-1α的mRNA表達(dá)量也較正常組和假手術(shù)組明顯升高，趨勢(shì)與蛋白表達(dá)一致；Apelin、APJ蛋白表達(dá)也較正常組和假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)，以復(fù)合型組表達(dá)增多最為明顯，肝內(nèi)型次之，肝前型升高較小。結(jié)論肝前型、肝內(nèi)型、復(fù)合型三種門脈高壓模型犬舌下絡(luò)脈均從宏觀和微觀方面出現(xiàn)相應(yīng)