APN抑制劑LJNK與基于APN的協(xié)同前藥Bc-A1的抗腫瘤活性研究.pdf

1、惡性腫瘤的致病因素多，發(fā)病機理復雜，這就造成了其治療的復雜性。目前惡性腫瘤的主要治療手段包括手術(shù)治療、化學治療和放射治療。傳統(tǒng)化學治療藥物都存在一定的毒副作用，長期使用容易產(chǎn)生耐藥性，限制了腫瘤的治療效果。
　　氨肽酶N是M1家族的金屬蛋白酶，可以從蛋白質(zhì)和多肽的氨基端降解中性氨基酸，從而參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答、神經(jīng)肽和細胞因子的降解、抗原呈遞、信號轉(zhuǎn)導以及血管生成等。APN在多種腫瘤組織中過度表達，與腫瘤的生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移

2、及腫瘤新生血管形成密切相關(guān)，抑制APN的過表達可以誘導腫瘤細胞凋亡。
　　本課題組通過前期的計算機虛擬篩選和初步活性測定，獲得了吲哚-2，3-酮類化合物LJNK，該化合物不僅對豬腎微粒體APN表現(xiàn)出了良好的抑制作用和一定的選擇性，而且在體外對人腫瘤細胞具有較強的抗增殖作用。在本課題的第一部分中，我們從多個方面對LJNK的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行了評價，對抗腫瘤作用機制進行了研究。
　　化療藥物吉西他濱在腫瘤的化學治療中起著重要作

3、用。然而，體內(nèi)迅速代謝失活限制了吉西他濱的臨床應(yīng)用。對吉西他濱N4位進行修飾和改造，可以減緩代謝失活，增加抗腫瘤活性，降低毒副作用。在實驗室前期工作中，以酰胺鍵將bestatin連接到吉西他濱N4位的氨基上，形成協(xié)同前藥BC-A1。初步活性研究證明了BC-A1在體外對APN酶具有良好的抑制活性。在本課題的第二部分中，我們從多個方面評價了化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分

4、吲哚-2，3-酮類APN抑制劑LJNK的抗癌活性研究
　　本課題從以下方面對化合物LJNK抗腫瘤活性進行了研究:
　　(1)LJNK與APN的相互作用:LJNK在和APN的分子對接實驗中，與酶的活性位點有效結(jié)合。用分光光度法測定了LJNK在體外對APN酶的抑制活性，實驗證明，LJNK競爭性結(jié)合APN，抑制作用優(yōu)于bestatin。
　　(2)體外抗血管生成活性:HUVEC二維管實驗和大鼠主動脈環(huán)實驗表明，LJNK和be

5、statin劑量依賴性的抑制腫瘤微血管形成，作用強于bestatin。
　　(3)體外抗侵襲活性:transwell實驗表明，LJNK對腫瘤細胞ES-2侵襲具有抑制作用，抑制作用的強度稍弱于陽性對照bestatin。
　　(4)體外抗增殖活性:MTT實驗和集落生成實驗都表明，LJNK對腫瘤細胞增殖具有抑制作用，作用強度強于bestatin。另外，非腫瘤細胞的MTT實驗結(jié)果表明，在有效抗腫瘤濃度下，LJNK對正常細胞的毒性作用

6、非常弱。
　　(5)體內(nèi)抗腫瘤增殖活性:通過昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型，測定了LJNK在體內(nèi)對腫瘤的抑制作用。連續(xù)給藥兩周后，LJNK80 mg/kg/d的腫瘤抑制率達到59.9％，并且實驗動物對LJNK有良好的耐受性。
　　(6)初步機制探討:以流式細胞術(shù)和熒光拍照的方法檢測了LJNK對腫瘤細胞凋亡的誘導作用。LJNK可以濃度依賴性的誘導腫瘤細胞凋亡，并且活性高于bestatin。進一步用免疫印跡和caspase酶活力

7、測定的方法，證明了LJNK和bestatin誘導腫瘤細胞中cleaved caspase3的表達水平上升，caspase3活力增加。
　　總之，LJNK能夠與APN有效結(jié)合，抑制APN酶活性，從而抑制腫瘤組織新生血管生成和腫瘤細胞侵襲。LJNK能夠在體內(nèi)外抑制腫瘤增殖，誘導細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。LJNK誘導凋亡與caspase3相關(guān)的凋亡通路有關(guān)。
　　第二部分 基于bestatin和吉西他濱的協(xié)同前藥BC-A1的抗癌活

8、性研究
　　本課題從以下方面對化合物BC-A1的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行了研究:
　　(1)APN酶抑制活性:用分光光度法測定BC-A1對APN酶的抑制活性。BC-A1和bestatin對豬腎微粒體APN酶抑制的IC50分別是12.11±2.17μM和4.59±0.43μM。
　　(2)體外抗血管生成作用:用HUVEC形成二維管實驗和大鼠主動脈環(huán)實驗測定了BC-A1對腫瘤組織新生血管形成的抑制作用，活性明顯高于陽性對照be

9、statin。
　　(3)體外抗侵襲活性:用transwell法測定了BC-A1對腫瘤細胞ES-2侵襲能力的影響。BC-A1作用于ES-2細胞，顯著抑制ES-2細胞的侵襲。
　　(4)體外抗增殖活性:首先用MTT實驗和集落生成實驗檢測了BC-A1、吉西他濱、吉西他濱-bestatin（摩爾比1∶1）、吉西他濱-bestatin(1∶10)對腫瘤細胞的增殖抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn)，增加bestatin的濃度并不能顯著增強抗增殖活性。

10、多株腫瘤細胞的MTT實驗證明，BC-A1對腫瘤的增殖抑制作用與吉西他濱相當。
　　(5)體內(nèi)抗增殖活性:通過昆明鼠皮下荷小鼠肝癌H22模型，測定了BC-A1的體內(nèi)抗腫瘤作用?？诜o藥低劑量BC-A1對腫瘤的體內(nèi)增殖具有良好的抑制作用，與靜脈注射更高劑量吉西他濱取得了相當?shù)寞熜А?br>　　(6)誘導凋亡活性:用流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，2μM的BC-A1作用于PLC/PRF/5細胞可以誘導腫瘤細胞凋亡。
　　總之，BC-A1保留了