海洋活性物質(zhì)——泥蚶多肽的研究與應(yīng)用.pdf

1、近半個世紀(jì)以來，“向海洋要藥”已成為沿海國家藥學(xué)研究的新方向，各國學(xué)者采用現(xiàn)代科學(xué)方法與技術(shù)從海洋生物中分離和鑒定出了多種具有抗腫瘤藥理作用的天然物質(zhì)，為研制開發(fā)抗腫瘤新藥奠定了基礎(chǔ)，顯示出誘人的研究開發(fā)前景，從海洋生物及其代謝產(chǎn)物中篩選和提取具有特異化學(xué)結(jié)構(gòu)的天然活性物質(zhì)成為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要來源。泥蚶(Arca granosa Linnaeus)，俗稱血蚶，在中國沿海各省都有分布。據(jù)《醫(yī)林纂要》注“蚶肉補心血、散瘀血、除煩醒酒、破

2、結(jié)消痰”的功能，泥蚶的有效成分及生理作用受到廣泛關(guān)注。本研究以泥蚶為原料，分離純化出一種活性多肽—泥蚶多肽，在初步觀察其抗腫瘤作用的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)進(jìn)行了抗腫瘤作用的實驗研究，并對其抗腫瘤作用的機(jī)理進(jìn)行了較全面、系統(tǒng)的探討，以期為該物質(zhì)的開發(fā)利用提供依據(jù)。 本研究通過水提取、大分子量蛋白質(zhì)熱變性去除、凝膠過濾柱層析工藝分離了一組多肽活性成分，蛋白含量為67.32±3.45mg/ml，分子量分布于1000—5000Da。通過體、內(nèi)外實

3、驗，系統(tǒng)觀察了該物質(zhì)的抗腫瘤作用。以小鼠為實驗對象，觀察了其對整體動物免疫功能的影響。體外以人肺腺癌細(xì)胞株A549，體內(nèi)以荷Iewis肺癌的C57BL/6雌性小鼠為研究對象，應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、單細(xì)胞凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)、免疫化學(xué)、RT-PCR及Western Blot方法和技術(shù)，系統(tǒng)探討了泥蚶多肽抗腫瘤作用的機(jī)理。最后，又系統(tǒng)研究了泥蚶多肽的毒理作用。 實驗結(jié)果表明，泥蚶多肽在O.125mg/ml-0.5mg/ml濃度范圍內(nèi)，可劑

4、量依賴性的降低三種腫瘤細(xì)胞(A549，NCI-H460和Kerr-3)DNA的合成和總蛋白的含量，抑制細(xì)胞的增值和克隆形成率，而對HepG-2，MCF-7和MGC-803腫瘤細(xì)胞株的抑制作用較小。靜脈注射給藥在50mg/kg-200mg/kg劑量條件下，泥蚶多肽能提高Iewis肺癌小鼠的延命率，改善小鼠的生存質(zhì)量。對小鼠S-180實體瘤、EAC腹水瘤具有治療作用，在10mg/kg-100mg/kg劑量條件下對小鼠S-180實體瘤、EAC

5、腹水瘤及肝癌實體瘤具有預(yù)防治療作用，且存在劑量依賴關(guān)系。同時泥蚶多肽對正常小鼠的非特異性免疫和特異性免疫也具有增強作用。泥蚶多肽在0.125mg/ml-0.5mg/ml濃度范圍內(nèi)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，損傷細(xì)胞DNA，將細(xì)胞周期阻滯于G<,2>/M期，其機(jī)理與該物質(zhì)損傷線粒體，降低線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及顯著抑制PCNA表達(dá)，增強Caspase-3活性和降低C—fos和C-jun蛋白表達(dá)有關(guān)。泥蚶多肽在50mg

6、／kg、100mg／kg、200mg／kg劑量范圍內(nèi)，對荷Lewis肺癌小鼠的腫瘤具有抑制作用，其機(jī)理與該物質(zhì)降低bcl-2mRNA、P53和P16蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)，增高Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)，但并不影響腫瘤組織中fas mRNA和C-myc的表達(dá)。毒理學(xué)研究結(jié)果表明，泥蚶多肽對小鼠自發(fā)活動次數(shù)和麻醉犬心率、血壓、心電圖各間期及呼吸頻率和深度無明顯影響。小鼠靜脈注射的最大耐受量大于2g／kg，小鼠皮下注射的最大耐受量大于5g／kg。

7、長期靜脈注射本物質(zhì)對Beagle犬體重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、心電圖、尿常規(guī)均無明顯影響，對24個臟器病理組織檢查均無明顯影響。Ames實驗證明泥蚶多肽的Ames實驗為陰性結(jié)果；對小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果提示，其對動物體細(xì)胞沒有明顯的致突變作用；對小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變實驗結(jié)果顯示，其對動物生殖細(xì)胞也沒有明顯的致突變作用。靜脈注射250mg／kg、100mg／kg、50mg／kg、10mg/Kg泥蚶多肽對孕鼠體重、胚胎形成、胎鼠