清香散對炎癥性腸病大鼠模型急性期療效及機(jī)理研究.pdf

1、研究背景 炎癥性腸病(IBD)為消化系疾病中研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)，因其病因不明，且在我國發(fā)病呈逐年上升之趨勢，所以治療十分棘手。目前國內(nèi)治療該病側(cè)重于中西醫(yī)結(jié)合為主。在中醫(yī)藥關(guān)于炎癥性腸病的認(rèn)識中，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)同以急性期與緩解期，分而治之，急性期以清熱利濕為主，屬于濕熱病證范疇。緩解期以健脾利濕為主。清香散為導(dǎo)師吳仕九教授多年從事濕熱證基礎(chǔ)與臨床研究的經(jīng)驗(yàn)方，功效清熱利濕，健脾和胃。 目的與意義 本實(shí)驗(yàn)研究利用三硝基

2、苯磺酸鈉(TNBS)法制作的炎癥性腸病大鼠模型，從以下幾個(gè)方面進(jìn)行探求：1、清香散對炎癥性腸病的治療作用，對TNBS大鼠一般癥狀如體重、腹瀉及便血狀況、髓過氧化物酶活力(MPO)、腸道粘膜損害及組織病理損害的影響；2、研究清香散對TNBS大鼠結(jié)腸組織超氧化物歧化酶活力(SOD)與丙二醛(MDA)含量影響，探討其治療炎癥性腸病的機(jī)理之一；3、研究清香散對TNBS大鼠腸組織一氧化氮(NO)含量與一氧化氮合酶(NOS)活力的影響，探討其治療炎

3、癥性腸病的機(jī)理之二；4、研究清香散對TNBS大鼠腸組織細(xì)胞因子白介素1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，從炎癥介質(zhì)角度探討其治療炎癥性腸病機(jī)理之三；5、研究清香散對TNBS大鼠腸組織細(xì)胞核中核因子kappB(NF-κB)活性影響，探討其治療炎癥性腸病機(jī)制之四；從上述多角度進(jìn)行炎癥性腸病的療效及機(jī)理研究，目的是為臨床治療該病，提高治療效果打下較為扎實(shí)的基礎(chǔ)。 材料與方法 1、實(shí)驗(yàn)動物分組：將60只220g

4、-250gSD大鼠隨機(jī)分為TNBS模型對照組、清香散低劑量組、中劑量組、高劑量組、柳氮橫胺吡啶組(SASP)及乙醇對照組6組，每組各10只。其中乙醇對照組為正常對照。大鼠禁食24h后，20％烏拉坦(0.5ml/只)腹腔注射麻醉后，外徑1.8mm橡膠管插入結(jié)腸，至距肛門約8cm處，將預(yù)混的120mg/kg5％TNBS和0.25ml的50％乙醇溶液注入結(jié)腸，乙醇組給予0.25ml的50％乙醇溶液，夾閉肛門，大鼠頭低位30min，自由食水，造

5、模后24h開始給藥。 結(jié)果 1、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠體重的影響 2、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠疾病活動指數(shù)(diseaseactivityindex，DAI)影響：腹瀉及便血是炎癥性腸病常見的癥狀，而疾病活動指數(shù)則是用來評估實(shí)驗(yàn)動物的腹瀉及便血情況。造模術(shù)后第7天時(shí)，清香散低、中、高劑量組及柳氮磺胺吡啶組的DAI值均低于TNBS模型對照組(P＜0.01)，而高于乙醇對照組(P＜0.01)。TNB

6、S模型對照組的DAI值高于乙醇對照組(P＜0.01)。以上結(jié)果表明清香散能改善TNBS模型大鼠的腹瀉與便血癥狀。 3、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸粘膜損害的影響 TNBS法IBD大鼠模型的機(jī)理首先為乙醇破壞了腸粘膜，然后TNBS作為半抗原與大分子結(jié)合，引起繼發(fā)免疫損傷。因此觀察結(jié)腸粘膜損害可以從大體上評價(jià)炎癥的輕重程度。 4、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織病理改變的影響 結(jié)腸組織病理學(xué)改

7、變是評價(jià)藥物作用療效的最有力的證據(jù)之一。對造模術(shù)后第7天時(shí)各組大鼠結(jié)腸組織HE染色標(biāo)本進(jìn)行評分。清香散各劑量組及柳氮磺胺吡啶組的組織病理損害評分均高于乙醇對照組(P＜0.01)，低于TNBS模型對照組(P＜0.01)，乙醇對照組的病理損害評分低于TNBS模型對照組(P＜0.01)，以上結(jié)果表明清香散能減輕TNBS模型大鼠結(jié)腸組織病理損害。 5、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠髓過氧化物酶(MPO)的影響 MPO是中性粒細(xì)

8、胞中含量較高的一種酶，其含量的增加可以反映中性粒細(xì)胞在某一組織中的增加，間接反映炎癥在組織中的存在，因此MPO常用作為評價(jià)急性炎癥程度的一種生化標(biāo)志。 6、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸一氧化氮(NO)與一氧化氮合酶(NOS)的影響：生理劑量的NOS及其誘導(dǎo)生成的NO對機(jī)體有保護(hù)作用，而在炎癥性腸病時(shí)，腸粘膜中NOS活力增加致NO過度生成，從而造成粘膜的損傷。而降低腸粘膜中NOS及其誘導(dǎo)生成的NO則能減輕腸粘膜的損傷。

9、 6.1清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸一氧化氮(NO)影響：對各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中NO含量檢測，TNBS模型對照組、清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NO值高于乙醇對照組(P＜0.001)，而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NO值低于TNBS模型對照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能減少TNBS模型大鼠腸組織NO含量。 6.2清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸一氧化氮合酶(NOS)影響：對各組大鼠造模

10、術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中NOS活力檢測，TNBS模型對照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NOS活力高于乙醇對照組(P＜0.001)。而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組NOS活力低于TNBS模型對照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能減少TNBS模型大鼠腸組織NOS活力。 從清香散各劑量組對TNBS模型大鼠結(jié)腸組織NOS與NO影響結(jié)果來看，清香散各劑量組能減少TNBS模型大鼠腸道組織中NOS活力以及其誘導(dǎo)過度生成的NO，對結(jié)腸

11、粘膜具有保護(hù)作用。 7、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織活性氧及自由基清除能力影響：活性氧與自由基在炎癥性腸病的發(fā)病中具有重要意義，提高機(jī)體活性氧及自由基清除能力能減輕炎癥。 7.1清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織超氧化物歧化酶(SOD)影響：體內(nèi)SOD能清除活性氧與自由基。對各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中SOD活力檢測，TNBS模型對照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組SOD活力低于乙醇對照組(P＜0

12、.001)。 7.2清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織丙二醛(MDA)影響：MDA為自由基損傷組織后的產(chǎn)物。對各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中MDA含量檢測，TNBS模型對照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組MDA含量高于乙醇對照組(P＜0.001)。而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組MDA含量低于TNBS模型對照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能降低TNBS模型大鼠腸組織MDA含量，提示清香散能減輕活性氧與自由基對

13、組織的損傷。 8、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織中炎性介質(zhì)mRNA如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)表達(dá)影響：TNF-α與IL-1β在炎癥性腸病的發(fā)病中起重要作用，目前有針對TNF-α單克隆抗體及IL-1受體分別用于炎癥性腸病的臨床，取得較好的效果，研究表明，炎癥性腸病急性期TNF-α與IL-1β表達(dá)減少，炎癥亦減輕。 8.1清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織中TNF-αmRNA表達(dá)影響

14、：對各組大鼠造模術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中TNF-αmRNA表達(dá)檢測，TNBS模型對照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組TNF-αmRNA表達(dá)量高于乙醇對照組(P＜0.001)。而清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組TNF-αmRNA表達(dá)量低于TNBS模型對照組(P≤0.002)。以上結(jié)果表明清香散能下調(diào)TNBS模型大鼠腸組織TNF-αmRNA表達(dá)。 8.2清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織中IL-1βmRNA表達(dá)影響：對各組大鼠造模

15、術(shù)后第7天時(shí)結(jié)腸組織中IL-1βmRNA表達(dá)檢測，TNBS模型對照組及清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組IL-1βmRNA表達(dá)量高于乙醇對照組(P＜0.001)。清香散各劑量組與柳氮磺胺吡啶組IL-1βmRNA表達(dá)量低于TNBS模型對照組(P＜0.001)。以上結(jié)果表明清香散能下調(diào)TNBS模型大鼠腸組織IL-1βmRNA表達(dá)。 9、清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠腸組織NF-KappB活性的影響：NF-κB是一個(gè)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，

16、廣泛參與多種基因特別是免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)基因如各種炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、粘附因子的表達(dá)調(diào)控，影響炎癥反應(yīng)過程。 結(jié)論 以上運(yùn)用清熱祛濕法及其代表方清香散對TNBS致結(jié)腸炎模型大鼠初步的治療結(jié)果及療效機(jī)制如下： 1、清香散能增加造模術(shù)后7天內(nèi)TNBS模型大鼠的體重，降低其造模術(shù)后第7天時(shí)疾病活動指數(shù)，減輕其造模術(shù)后第7天時(shí)粘膜損害及組織學(xué)病理損害，降低造模術(shù)后第7天時(shí)組織中MPO活力。提示清香散對TNBS模型大鼠急

17、性期療效確切。 2、清香散能增加造模術(shù)后第7天時(shí)TNBS模型大鼠結(jié)腸組織中SOD活力而降低其MDA含量，表明其能提高TNBS模型大鼠腸組織清除活性氧及自由基的能力。提示清香散增強(qiáng)清除活性氧及自由基能力可能為其治療炎癥性腸病急性期的機(jī)制之一。 3、清香散能降低造模術(shù)后第7天TNBS模型大鼠結(jié)腸組織中NOS活力及NO含量。提示清香散降低NOS活力與NO過度表達(dá)可能為其治療炎癥性腸病急性期的機(jī)制之一。 4、清香散能下調(diào)