浮游態(tài)和生物被膜狀態(tài)嗜水氣單胞菌對四環(huán)素耐藥相關蛋白的研究.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種典型的人-獸-魚共患病病原菌，可引起動物的敗血癥和人類腹瀉，同時也是水產養(yǎng)殖中常見的條件致病菌，每年由該菌導致的魚類爆發(fā)性流行病給水產養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經濟損失，引起研究人員的高度重視。目前水產養(yǎng)殖中常常使用抗生素預防與治療魚類疾病，導致嗜水氣單胞菌等病原菌產生耐藥性。此外，嗜水氣單胞菌在自然環(huán)境中易形成生物被膜，一種與浮游態(tài)相對應的生活方式，在細菌耐藥與致病過程中發(fā)揮重要作用

2、。因此研究浮游態(tài)和生物被膜狀態(tài)下嗜水氣單胞菌抗生素耐藥相關蛋白及其功能，對治療與預防該菌具有重要的意義。
　　本試驗首先采用 TMT標記結合 LC-MS/MS質譜分析的定量蛋白質組學技術，以生物被膜狀態(tài)下的嗜水氣單胞菌為研究對象，對金霉素(Chlortetracycline，CTC)應激與遺傳獲得性耐藥兩種條件下，細菌表達差異蛋白進行了較系統(tǒng)的比較分析。結果發(fā)現，應激處理下(即Ah-CTC-O+CTC比Ah-CTC-O)共有66個

3、蛋白發(fā)生變化，其中24個蛋白下調表達，42個蛋白上調表達，而獲得性耐藥性下(即Ah-CTC-R比Ah-CTC-O)有66個蛋白下調表達，75個蛋白上調表達，共141個蛋白發(fā)生變化。細菌在應對抗生素脅迫的應激性耐藥，以及獲得性耐藥性之間，具有中度的相關性，提示兩者具有密切的進化聯系。生物信息學分析發(fā)現，翻譯相關蛋白在兩者之間都顯著性上調表達，脂肪酸生物合成相關蛋白在應激性下上調表達，其他一些代謝途徑包括丙酸代謝、不同環(huán)境中的微生物代謝和次

4、生代謝產物的生物合成相關蛋白在獲得性耐藥中表達下降。然后利用 q-PCR技術比較脂肪酸生物合成和丙酸代謝相關基因 mRNA的轉錄表達，發(fā)現脂肪酸生物合成途徑的轉錄水平與蛋白質表達水平基本一致，而丙酸代謝途徑的轉錄水平表現為較大的波動，約50-60％的相關基因轉錄水平與蛋白水平一致。最后，通過測定CTC與脂肪酸生物合成抑制劑三氯生（Triclosan，TCS）協(xié)同作用下細菌的存活率，發(fā)現當抑制脂肪酸合成途徑后，細菌對抗生素顯著敏感。進一步

5、通過Western blotting技術驗證脂肪酸生物合成途徑中的FabD蛋白在敏感菌和耐藥菌中CTC和TCS作用下的蛋白表達變化。試驗結果提示FabD等脂肪酸生物合成相關蛋白在生物被膜下的細菌耐藥過程中起著重要作用，同時提出脂肪酸生物合成抑制劑與四環(huán)素類型抗生素聯用，可以有效抑制細菌的新策略。
　　其次，采用iTRAQ標記的定量蛋白質組學技術，分析浮游態(tài)嗜水氣單胞菌在CTC應激和獲得性耐藥性下的差異蛋白。結果發(fā)現，應激處理下有1

6、16個蛋白上調表達，194個蛋白下調表達，共有310個蛋白發(fā)生變化；而獲得性耐藥性中共有252個蛋白發(fā)生變化，93個蛋白上調表達，159個蛋白下調表達。同時發(fā)現應激性和獲得性耐藥性之間共有92個重疊蛋白，表明應激性和獲得性耐藥性之間有相同的耐藥機制應對抗生素脅迫。進而對差異蛋白進行生物信息學分析，發(fā)現核糖體亞基蛋白在二者之間都顯著性上調表達，與生物被膜結果一致。而細菌趨化性相關蛋白在獲得性耐藥性中主要是下調表達。然后利用 q-PCR技術