干擾素-λ1對慢性HBV感染青少年患者外周血清來源樹突狀細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：現(xiàn)研究認(rèn)為乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)主要通過宿主免疫應(yīng)答與免疫反應(yīng)引起肝細(xì)胞的損傷和破壞，由于宿主的免疫反應(yīng)不同HBV感染所引起的臨床表現(xiàn)和轉(zhuǎn)歸各不相同。根據(jù)免疫學(xué)特點(diǎn)，嬰幼兒期HBV感染自然過程在臨床上可以分為四期，①免疫耐受期；②免疫清除期；③非活動HBV攜帶狀態(tài)；④再活動期，目前HBV感染慢性化的確切機(jī)制尚不明確。HBV感染后樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)抗原提呈功能低下可能

2、是HBV感染慢性化的原因之一。DC是目前所知機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的APC(antigen-presenting cell，APC)，DC作為機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)的始動、調(diào)節(jié)和效應(yīng)者，具有激括CD8+CTL和CD4+T輔助細(xì)胞的能力，控制著體內(nèi)免疫反應(yīng)的過程，因而DC已成為機(jī)體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC最大特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始T細(xì)胞進(jìn)行增殖，而巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞僅能刺激已活化或記憶性T細(xì)胞，所以DC在免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中具有獨(dú)特地位，是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者。

3、成熟DC可高表達(dá)CD80、CD83、CD86和HLA-DR的細(xì)胞表面分子。干擾素λ(interferon-λ，IFN-λ)是2003年由美國科學(xué)Kotenko和Sheppard等應(yīng)用生物信息學(xué)手段從人的基因組中共同發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素，包括IFN-λ(IL-29)，IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。近年研究發(fā)現(xiàn)干擾素λ主要來源于DC并且對DC的成熟和功能具有重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)IFN-λ1能誘導(dǎo)DC的成熟以及

4、增強(qiáng)它的抗原提呈功能。關(guān)于報(bào)道干擾素λ在丙型病毒性肝炎中的研究進(jìn)展很多，但在慢性HBV感染過程中對DC功能的影響在國內(nèi)外報(bào)道很少。
　　本研究旨在探討干擾素λ1對HBV慢性感染青少年患者免疫耐受期與免疫清除期外周血來源DC細(xì)胞功能的影響及臨床意義。
　　方法：選取青少年慢性HBV感染者34例，其中免疫耐受期18例，免疫清除組16例，健康對照10例。所有慢性乙型肝炎患者均行肝組織活檢，炎癥分級為G0～G4，纖維化程度分為S0～

5、S4。
　　1體外DC培養(yǎng)：留取受試者和正常者新鮮外周靜脈血，密度梯度離心法分離PBMC，無血清培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞，收集貼壁細(xì)胞分三組：單獨(dú)組(重組人白介素-29)；正常培養(yǎng)組(重組人白介素-4、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)；IFN-λ1組(重組人白介素-4、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和重組人白介素-29)共同培養(yǎng)，均培養(yǎng)7天。
　　2培養(yǎng)過程中在倒置顯微鏡下觀察各組DC成熟狀態(tài)
　　3收集成熟DC用P

6、E-DC80、PE-CD83、PE-CD86和PE-HLA-DR抗體進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)情況。
　　4收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測INF-γ，IL-12分泌情況。
　　結(jié)果：
　　1 DC形態(tài)學(xué)觀察：PBMC經(jīng)2-4小時貼壁后，可見部分細(xì)胞懸浮，多數(shù)為B細(xì)胞和外周血DC；單獨(dú)組(IL-29)在培養(yǎng)第2、5和7天后未見貼壁細(xì)胞有形態(tài)改變，延長至11天后仍未變化；正常培養(yǎng)組(IL-4、GM-CSF)與IFN

7、-λ1組(IL-4、GM-CSF和IL-29)培養(yǎng)過夜后貼壁細(xì)胞數(shù)量有所減少，細(xì)胞體積?。徽T導(dǎo)培養(yǎng)2天后可見貼壁細(xì)胞伸展，形態(tài)明顯改變，培養(yǎng)5天后細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，粗細(xì)不等的毛刺多而密，成典型的DC形態(tài)；第7天DC表面突起更加明顯；在IFN-λ1組(IL-4、GM-CSF和IL-29)可見細(xì)胞成簇，并且大量突起交織。
　　2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)果：培養(yǎng)7天后，免疫耐受組和免疫清除組DC表面分子CD80、CD83、CD86和H

8、LA-DR表達(dá)均低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；免疫清除組DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR表達(dá)高于免疫耐受組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；經(jīng)過IL-29誘導(dǎo)后DC高表達(dá)CD80、CD83、CD86和HLA-DR并且免疫清除期患者的表達(dá)明顯高于免疫耐受期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)
　　3細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測結(jié)果：免疫清除期比免疫耐受期患者DC分泌IL-12和IFN-γ功能強(qiáng)，

9、但均明顯低于正常人，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。通過IL-29聯(lián)合培養(yǎng)誘導(dǎo)后可顯著提高DC分泌IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子功能，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1利用患者外周血獲取PBMC，運(yùn)用貼壁培養(yǎng)法去除懸浮細(xì)胞可成功獲得DC。單獨(dú)加入IL-29培養(yǎng)不能誘導(dǎo)DC成熟，加入IL-4、GM-CSF聯(lián)合培養(yǎng)后能明顯促進(jìn)和誘導(dǎo)外周血來源DC的成熟。
　　2慢性HBV感染者中免疫耐受期患者DC