湖北麥冬抗II型糖尿病活性與物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、湖北麥冬(Liriope spicata (Thunb.)Lour．Var．Prolifera Y．T．Ma)是湖北省的道地藥材，是中藥麥冬的主流品種之一。在中醫(yī)臨床上湖北麥冬與杭麥冬和川麥冬等同入藥，用于治療熱病傷津、心煩口渴等癥。在古今治療糖尿?。ㄏ什。┑闹兴帍?fù)方中麥冬常作為主藥，近年多位學(xué)者就麥冬的“消渴”作用做了一些抗糖尿病研究，表明川、杭麥冬具有抗糖尿病的作用，并初步證明其發(fā)揮抗糖尿病作用的活性物質(zhì)主要是麥冬多糖。對湖北麥冬

2、多糖降血糖的相關(guān)研究在國內(nèi)外還未見公開報道，但湖北麥冬多糖極可能也具有降血糖活性。鑒于此，在國家自然科學(xué)基金和國家十一五科技支撐計劃的資助下，本論文對湖北麥冬抗II 型糖尿病活性、活性物質(zhì)（湖北麥冬多糖）的制備工藝、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了研究。
　　 本論文由四個部分組成。第一部分為湖北麥冬抗II 型糖尿病的活性及作用機(jī)理研究，證實湖北麥冬抗II 型糖尿病活性，確定其活性物質(zhì)基礎(chǔ)為多糖成分，并推測改善胰島素抵抗是其抗II 型糖

3、尿病機(jī)理之一。第二部分為湖北麥冬多糖（TLSP）制備工藝研究，確定出一條穩(wěn)定、天然、高效的湖北麥冬多糖實驗室制備路線。第三部分是湖北麥冬多糖(TLSP)的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)研究，獲得了TLSP 及從中分離出的均一多糖(LSP1和LSP2)穩(wěn)定的理化參數(shù)，并解析出LSP1和LSP2的一級結(jié)構(gòu)特征。第四部分是綜述，對2005年1月至2010年12月報道的具有潛在抗糖尿病活性的單體化合物進(jìn)行了概括。
　　 第一部分
　　 為探究湖

4、北麥冬是否具有抗糖尿?。↖I 型糖尿?。┗钚?、活性物質(zhì)是什么，本研究首先采用高脂高糖飼料+小劑量STZ 誘導(dǎo)的II 型糖尿病小鼠模型，對湖北麥冬抗糖尿病活性成分提取溶劑（95％乙醇或水）進(jìn)行篩選研究，確定只有水提取物（WE）
　　 具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性（降低糖尿病小鼠的空腹血糖（P<0.01），改善糖尿病小鼠糖耐量（P<0.01））。
　　 接著，本研究對湖北麥冬水提取物（WE）進(jìn)行分離、純化，得到湖北麥冬粗多糖（CP

5、）、總多糖（TLSP）及無糖部位（NP），并采用同樣的動物模型對各部位進(jìn)行活性篩選，確定WE、CP、TLSP 均具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性（降血糖及改善糖耐量，P<0.01），活性強(qiáng)度依次為WE＜CP＜TLSP，非糖部位（NP）無抗糖尿病活性。多糖純度最高的TLSP 具有最好的活性，說明TLSP是湖北麥冬主要的抗糖尿病活性成分。
　　 為進(jìn)一步探討湖北麥冬多糖的抗II 型糖尿病活性物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究又對TLSP 進(jìn)行分離純化，得到均一

6、多糖1（LSP1）和2（LSP2），并采用同樣的動物模型對TLSP、LSP1和LSP2 進(jìn)行活性比較。實驗結(jié)果證實，TLSP、LSP1和LSP2 均可顯著降低II型糖尿病小鼠的血糖（P<0.01），改善糖耐量（P<0.01）和降低胰島素抵抗指數(shù)（P<0.01），各項作用強(qiáng)度與羅格列酮比較沒有顯著性差異（P>0.05）。而且能降低血總膽固醇（P<0.01）和甘油三酯（P<0.01）、增加高密度脂蛋白相對含量（P<0.01）并降低低密度脂蛋

7、白水平（P<0.01），其效果均較羅格列酮好（P<0.05或P<0.01），體現(xiàn)湖北麥冬多糖能從多方面綜合治療糖尿病、緩解其癥狀。通過各方面綜合比較，確定三者抗II型糖尿病活性強(qiáng)度基本相當(dāng)：TLSP≈LSP1≈LSP2，100 mg/kg≈200 mg/kg。由于TLSP的制備工藝相對簡單，工業(yè)生產(chǎn)周期短、成本低。因此本項目組選擇TLSP 為候選藥物進(jìn)行后續(xù)開發(fā)，并初步確定其對小鼠的有效劑量為100mg/kg。
　　 同時，在對

8、TLSP、LSP1和LSP2的藥效學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)TLSP、LSP1和LSP2均具有改善胰島素抵抗（HOMA-IR）的作用，因此，本課題順著胰島素抵抗這條路線，研究湖北麥冬多糖對改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和肝糖代謝的影響，以初步探究抗II 型糖尿病機(jī)理。機(jī)理研究結(jié)果表明，TLSP、LSP1和LSP2 均能明顯提高糖尿病小鼠腎臟組織中胰島素信號因子—胰島素受體（InsR）、胰島素受體底物-1（IRS-1）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）的表達(dá)水

9、平（P<0.01），進(jìn)而改善胰島素信號傳導(dǎo)，增加組織對胰島素的敏感性，從而改善糖尿病癥狀，這是湖北麥冬多糖抗糖尿病機(jī)理之一。
　　 同時，TLSP、LSP1和LSP2 還能增加肝糖原含量（P<0.01）及葡萄糖激酶 (GcK)活性（P<0.01），降低葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）活性（P<0.01），從而改善糖尿病小鼠肝內(nèi)糖代謝紊亂，增強(qiáng)肝細(xì)胞合成糖原及促進(jìn)葡萄糖利用，進(jìn)而改善糖尿病癥狀，這是湖北麥冬多糖抗糖尿病機(jī)理之二。

10、>　　 第二部分
　　 在確定以湖北麥冬多糖TLSP 作為抗糖尿病候選藥物開發(fā)后，本研究分別采用正交和單因素實驗對TLSP的沸水提取、酶解除蛋白質(zhì)、透析除小分子、醇沉及DEAE-纖維素柱層析脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)反復(fù)驗證，得到一條穩(wěn)定的TLSP 制備路線。確定出的制備路線為：
　　 取湖北麥冬干燥塊根的粗粉，煎煮3 次，每次加入水的體積分別為粗粉重量的4、4和2 倍，每次30分鐘，合并濾液，60℃減壓濃縮得到6 倍藥材體

11、積粗多糖液；將粗多糖液調(diào)節(jié)pH 6和水浴溫度45℃，加入0.3％藥材量的木瓜蛋白酶（12U/mg），酶解2 小時，將酶解后的多糖液煮沸5min，靜置放冷，抽濾去沉淀。然后將濾液裝入透析袋(Mw1000)（裝入的液體量不超過透析袋容積的2/3）用自來水和蒸餾水各透析1天，去除小分子。透析后的袋內(nèi)多糖液（保留部分）縮到原藥材重量的1.5倍體積，加入95％的乙醇，以乙醇終濃度80％在室溫下（20±2℃）醇沉24h，收集沉淀；上清液減壓濃縮到原

12、藥材重量的1.0 倍體積，再加入95％的乙醇，以乙醇終濃度80％在室溫下（20±2℃）再醇沉24h，收集沉淀；合并沉淀部分，真空/冷凍干燥獲得湖北麥冬粗多糖。湖北麥冬粗多糖蒸餾水溶解、調(diào)節(jié)濃度0.2g/mL，采用DEAE-纖維素52層析柱脫色純化，上樣體積5mL/g 填料，上樣及洗脫流速2.5柱體積/h（BV/h），蒸餾水/純水為洗脫劑，水洗量3 BV，收集量6 BV（從上樣后第2 BV的下柱液開始收集）。收集到的多糖液減壓濃縮、真空/

13、冷凍干燥即得湖北麥冬多糖TLSP。
　　 第三部分
　　 為了更好的對湖北麥冬多糖（TLSP）進(jìn)行質(zhì)量控制，本論文對TLSP的理化性質(zhì)及其主要的組成成分（LSP1和LSP2）的一級結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 （1）從TLSP中分離得到2個結(jié)構(gòu)新穎的均一多糖，LSP1和LSP2，兩均一多糖分別占TLSP的25.4％和64.2％
　　 （2）運(yùn)用多種物理、化學(xué)方法對TLSP、LSP

14、1和LSP2的常規(guī)理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，獲得了TLSP、LSP1和LSP2 穩(wěn)定的理化參數(shù)。
　　 （3）運(yùn)用多種光譜、色譜、化學(xué)等方法對LSP1和LSP2的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，獲得LSP1和LSP2 較精確的結(jié)構(gòu)信息。LSP1 為小分子果聚糖（Mw 為3199），聚合度為20，由19個β-D-果糖和1個α-D-葡萄糖構(gòu)成；其主鏈?zhǔn)且?、2 鏈接的果糖殘基構(gòu)成，有6個重復(fù)單元，每個單元包含1個1、2 位連接的雙取代果糖殘基、1個1、

15、2、6 位連接的三取代果糖殘基和1個2 位連接的單取代果糖殘基；多糖主鏈的一個末端以2 位羥基與1個α-D-葡萄糖的1 位羥基鏈接成苷，另一個末端以1 位羥基與1個β-D-果糖的2 位羥基鏈接成苷。LSP2 也為小分子果聚糖（Mw 為4287），聚合度為26，由25個β-D-果糖和1個α-D-葡萄糖構(gòu)成；其主鏈?zhǔn)且?、2 鏈接的果糖殘基構(gòu)成，有6個重復(fù)單元，每個單元包含2個1、2 位連接的雙取代果糖殘基、1個1、2、6 位連接的三取代果

16、糖殘基和1個2 位連接的單取代果糖殘基；多糖主鏈的一個末端以2 位羥基與1個α-D-葡萄糖的1 位羥基鏈接成苷，另一個末端以1 位羥基與1個β-D-果糖的2 位羥基鏈接成苷。
　　 第四部分
　　 本部分對2005年1月至2010年12月報道的具有抗糖尿病潛力的單體化合物進(jìn)行了概括，側(cè)重于介紹從藥用植物分離獲得的一些具有抗糖尿病活性的化合物（包括已知的和新發(fā)現(xiàn)的），包括皂甙、黃酮、生物堿、蒽醌類、萜類、香豆素類、酚類、多