mTOR及其底物S6K1在小鼠受精卵中的表達及作用.pdf

1、mTOR(mammaliantargetofrapamycin)蛋白是一種結(jié)構(gòu)與功能保守的蛋白質(zhì)，是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶家族成員，具有絲/蘇氨酸激酶活性，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的中心調(diào)控因子。mTOR受生長因子、胰島素、營養(yǎng)物質(zhì)、ATP等的調(diào)節(jié)，并通過其下游靶蛋白S6K1、4EBP1調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯，促進細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡，并與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在一些經(jīng)原癌基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，mTOR處于持續(xù)的活化狀態(tài)。mTOR對細(xì)胞周期也有調(diào)控作用，促進G

2、1期細(xì)胞進入S期。此外mTOR在胚胎的早期發(fā)育中也起到關(guān)鍵性的作用，因為敲除mTOR基因的小鼠在著床后很快死亡，S6K1和S6K2基因敲除的小鼠多在圍產(chǎn)期死亡。但是在胚胎發(fā)育中mTOR以及S6K1的具體作用到底是什么，該作用從什么時候開始還不清楚。本實驗主要研究受精卵中mTOR、S6K1的表達、分布及作用。從而使我們一方面對mTOR信號途徑的生理作用有進一步的認(rèn)識，另一方面也更加深我們對哺乳動物受精卵早期發(fā)育機制的認(rèn)識。 實驗

3、方法： 1.小鼠超排卵及取卵： 2.RT-PCR檢測檢測卵細(xì)胞中mTOR和S6K1的mRNA的表達： 200個MII卵或各期受精卵收集到2ml微量離心管中，按QuickPrepmicromRNAPurification試劑盒說明書進行：主要包括：樣品的提取，mRNA的分離，分別用高鹽緩沖液和低鹽緩沖液對已結(jié)合mRNA的ologo(dT)纖維顆粒的洗滌，mRNA的洗脫。用TaKaRaRNAPCR(AMV)Ve

4、r3.0試劑盒，按操作步驟進行反轉(zhuǎn)錄和PCR：mTOR的引物：5’-TGATGGTGAGT-GAAGAGCTGATTCGGGTAG-3，和5’-TTGGTGGACAGAGGGATGA-CAGCGTATCTC-3’，預(yù)計產(chǎn)物長度670bp；PCR反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件是①94℃，2min；②94℃，30sec；③53℃，30sec；④72℃，45sec；⑤72℃，10min；②-④循環(huán)37周；S6K1引物為5’-ACTTCGGGTA

5、CTTGGTAAAGG-3’，5’-GATGTTCTCCGGCTTCA-3’，預(yù)計產(chǎn)物長度為393bp；PCR反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件：①94℃，2min；②94℃，30sec；③53℃，30sec；④72℃，30sec；⑤72℃，10min；②-④循環(huán)33周；以β-actin作為內(nèi)對照，引物為：5’-GTGGCATCCATGAAACTACAT-3’，5’-AACGCAGCTCAGTA-ACAGTC-3’。反應(yīng)產(chǎn)物終瓊脂糖凝膠電泳后

6、成像。 3.Westernblot檢測卵細(xì)胞中mTOR和S6K1在蛋白水平的表達： 收集MII卵及各期受精卵，每道300個卵；樣品蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC膜)上，分別與一抗和二抗，增強型化學(xué)發(fā)光法顯色，在暗室中使X光膠片曝光。 4.免疫熒光檢測mTOR和S6K1在卵細(xì)胞中的分布： 將現(xiàn)取出的或經(jīng)過一定時間培養(yǎng)的卵細(xì)胞，以4％多聚甲醛固定，0.1％TritonX-10

7、0打孔；封閉1小時后，分別與一抗和FITC標(biāo)記的二抗孵育后，用用碘化丙啶使DNA染色；熒光顯微鏡觀察，照像。 5.mTOR活性的測定： 收集的MII卵，按實驗需要定時收集受精卵，5-10個/管，加入5μlNP40緩沖液，將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解，加入反應(yīng)液20μl，30℃反應(yīng)30分鐘，取25μl點于WhatmanP81強陽離子交換濾紙上，75mmol/L磷酸溶液終止反應(yīng)后，將濾紙置于液閃瓶內(nèi)，用Backman液

8、閃計數(shù)儀測定cpm值。以注射hCG后時間為橫坐標(biāo)，以cpm值為縱坐標(biāo)繪制mTOR活性變化時間曲線。各組實驗重復(fù)3次。 6.雷帕霉素(rapamycin)處理對卵裂率的影響： 于hCG注射后17h處死雌鼠，取受精卵，將卵細(xì)胞于M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)，實驗組，M16培養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的雷帕霉素(溶于二甲基亞砜)，對照組加入與實驗組相同體積的二甲基亞砜，培養(yǎng)到注射hCG后32-33小時，相差顯微鏡觀察卵細(xì)胞分裂情況，計算各組

9、卵細(xì)胞的分裂率。 7.雷帕霉素以及渥曼青霉素(wortmannin)對MPF活性的影響： 于注射hCG后17小時收集受精卵，于M16培養(yǎng)液，37℃，5％CO2中培養(yǎng)，實驗組1，于培養(yǎng)液中加入雷帕霉素(終濃度3.3μg/ml)，實驗組2于培養(yǎng)液中加入渥曼青霉素(終濃度20μM)，對照組中加入與實驗組相同體積的二甲基亞砜。定時從各組中收集卵細(xì)胞，將細(xì)胞收集到微量離心管中，每5-10個細(xì)胞，加入5μlNP40緩沖液，將卵細(xì)

10、胞反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解，加入反應(yīng)液20μl，30℃反應(yīng)30分鐘，取25μl點于WhatmanP81強陽離子交換濾紙上，75mmol/L磷酸溶液終止反應(yīng)，將濾紙置于液閃瓶內(nèi)，用Backman液閃計數(shù)儀測定cpm值。以注射hCG后時間為橫坐標(biāo)，以cpm值為縱坐標(biāo)繪制mTOR活性變化時間曲線。各組實驗重復(fù)3次。 8.雷帕霉素對cyclinB表達的影響： 于注射hCG后17小時收集受精卵，于M16培養(yǎng)液，37℃，5％CO

11、2中培養(yǎng)到hCG后28.5小時收集卵細(xì)胞，實驗組中加入雷帕霉素(終濃度3.3μg/ml)，對照組中加入相同體積的二甲基亞砜。將收集的卵細(xì)胞，每組150個，westernblot檢測cyclinB的表達。 結(jié)論：1.在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中，mTOR及其下游底物S6K1在mRNA和蛋白水平都有表達。S6K1在S期出現(xiàn)一定程度的磷酸化，說明從S期開始S6K1被活化。 2.mTOR的激酶活性在受精卵后迅速升高，并保持高活性