粘細菌纖維堆囊菌降解纖維素多酶復合體的確證和性質(zhì)分析.pdf

1、粘細菌是一類特殊的革蘭氏陰性桿菌，能夠進行滑行運動，具有復雜的多細胞行為和形態(tài)發(fā)生過程，是一類“生活在真核生物邊緣”的高等的原核生物類群；產(chǎn)生眾多結(jié)構(gòu)新穎、作用機制獨特的生物活性次級代謝產(chǎn)物是粘細菌的另一重要特征。根據(jù)“食性”的差異可將粘細菌簡單的劃分為溶細菌和溶纖維素兩個生理類群。溶纖維素群中只有堆囊菌屬一個屬，纖維堆囊菌是其中的模式種。作為重要的微生物藥物(例如著名的埃博霉素)產(chǎn)生菌，纖維堆囊菌逐漸引起全球的廣泛關(guān)注。但是，對其最為

2、基本的微生物學特性——粘細菌中唯一能夠降解纖維素、半纖維素等生物大分子的類群，相關(guān)研究則涉及很少。本文利用實驗室所建立的國內(nèi)最大的粘細菌資源庫的優(yōu)勢，對纖維堆囊菌降解纖維素的基本性質(zhì)及相關(guān)酶類進行了研究。 纖維素是地球上最豐富的可再生有機資源，對纖維素的降解基本上是由微生物完成的。不同微生物降解纖維素時所采取的策略也不盡相同，主要表現(xiàn)在各種降解酶類的作用機制和組織形式上。纖維堆囊菌能夠在以纖維素為唯一碳源的簡單無機鹽培養(yǎng)基(如C

3、NST培養(yǎng)基)上生長，可產(chǎn)生多種纖維素和半纖維素酶類。所以，我們從表征其纖維素酶類的基本性質(zhì)出發(fā)，開展了相關(guān)研究。廣泛選取了13株纖維堆囊菌作為研究對象，對其在不同纖維素底物上的生長形態(tài)、降解纖維素特征、分化發(fā)育能力以及多種纖維素和半纖維素酶類的產(chǎn)生時間進行了測定和比較。通過對各菌株在濾紙纖維素底物上生長和子實體形成情況的分析，我們將其總結(jié)為兩種不同的類型：一種類型是以接種點為中心，先向四周快速擴展，在擴展過程中伴隨著濾紙纖維素的降解，

4、達到一定程度以后，整個菌落的細胞同時開始聚集，并形成子實體結(jié)構(gòu)，其子實體基本在生長同一時期形成，并布滿整個菌落，這種類型的特點就是幾乎所有的菌體細胞都處于相同的生長時期，細胞生長和分化發(fā)育具有一定的同步性；另一種類型是在菌落外圍菌體細胞仍在增殖擴展時，靠近中心部位的菌體則已開始聚集和進入分化發(fā)育階段，首先形成子實體結(jié)構(gòu)，隨著培養(yǎng)時間的延長，外圍細胞也逐漸形成子實體結(jié)構(gòu)，其子實體最終布滿菌落中心部位或整個菌落，這種類型的特點就是菌落中不同

5、部位的細胞所處的生長時期并不完全一致，從中心到外圍具有不規(guī)則的階梯性。纖維堆囊菌對于其它纖維素類底物也表現(xiàn)出了良好的降解能力。13株菌株都可以在羧甲基纖維素(CMC)和木聚糖平板上生長，經(jīng)剛果紅染色形成透明的降解圈：部分菌株還可在木聚糖和微晶纖維素平板上形成大型菌膜。酶活性分析表明，纖維堆囊菌的纖維素酶類是與細胞和纖維素底物相結(jié)合的，但酶活性偏低，與其快速降解纖維素的能力不相符。同時發(fā)現(xiàn)各種酶的活性不僅總體變化趨勢比較相似，而且在時間上

6、也有較強的同步性。在對纖維堆囊菌降解纖維素大分子的性質(zhì)有了基本認知后，我們選擇Sorangium cellulosum S09733-1作為后續(xù)實驗的模式材料。 首先，我們對S09733-1在濾紙纖維上的細胞行為進行了表征。通過掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在菌體的生長階段，只有與菌體接觸到的纖維才能夠被降解，而且處于此階段的菌體表面產(chǎn)生了一種疣狀突起結(jié)構(gòu)；在生長后期細胞發(fā)生聚集并開始分化發(fā)育過程時，伴隨纖維素降解的停止此結(jié)構(gòu)消失。我

7、們推測此種突起結(jié)構(gòu)可能與纖維素降解相關(guān)。 然后，對S09733-1的纖維素酶系進行了分離純化。利用兩步抽提法和凝膠層析技術(shù)，我們得到了一個分子量在1000-2000KDa之間、具有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、葡萄糖苷酶等多種酶活力的高分子量組份。經(jīng)SDS-PAGE和HPLC分析，進一步確定此高分子量組份分子量范圍在1500-2000KDa之間，由10個以上的蛋白組成，具有多種不同的纖維素降解酶活，初步證實了纖維堆囊菌中

8、可能存在一類降解纖維素的多酶復合體。為了進一步證實這一結(jié)論，我們采取了兩條基本思路：一是從單一酶組分出發(fā)，克隆并異源表達復合體中的一個酶組分，以此作為探針，對復合體進行細胞定位，并揭示其與細胞表面突起結(jié)構(gòu)的關(guān)系；另一思路是對于復合體中所有蛋白組分進行分析和鑒定，在闡明其基本功能的基礎(chǔ)上，揭示復合體的結(jié)構(gòu)組織模式。 本實驗室在前期工作中，利用各種纖維素、半纖維素降解酶類基因設(shè)計引物對S09733-1基因組進行了PCR擴增，但是由于

9、纖維堆囊菌與其它纖維素降解微生物的低同源性，我們只獲得了幾個木聚糖酶基因?？紤]到復合體中表現(xiàn)出了較高的木聚糖酶活性，我們選取了其中一個木聚糖酶的催化域(糖苷水解酶第10家族)編碼片段xynF，將之插入表達載體pET-22b(+)，在受體菌株Ecoli BL21(DE3)中進行異源表達。重組蛋白XynF在胞內(nèi)形成包涵體。經(jīng)包涵體提取并利用其帶有的組氨酸標簽用Ni2<'2+>柱的方法進行了分離純化。以純化的重組蛋白XynF為抗原進行抗體制備

10、，獲得了效價為1：16的多克隆抗體。以此多克隆抗體為一抗，進行了S09733-l降解纖維素多酶復合體的免疫印跡分析。結(jié)果顯示，該多克隆抗體不僅可以與XynF發(fā)生強烈結(jié)合，還可以與本實驗室得到的S09733-1中另兩個完整木聚糖酶基因異源表達蛋白XynA和XynB發(fā)生交叉反應，因為其催化結(jié)構(gòu)域同屬于糖苷水解酶第10家族(F／10)。對S09733-1木聚糖酶基因xynA和xynB所編碼的氨基酸序列進行比對和3D結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，兩個蛋白都只有

11、兩個結(jié)構(gòu)域，一個為F／10家族催化域，另一個為一疏水結(jié)構(gòu)域，功能未知。此種結(jié)構(gòu)與纖維小體中的組成酶類有一定的相似之處。在對SDS．PAGE后的復合體進行免疫印跡分析時，出現(xiàn)三條雜交條帶，說明在此酶復合體中至少存在三種具有F／IO家族催化域的木聚糖酶。 通過間接免疫熒光實驗，對復合體的細胞分布進行了定位，結(jié)果表明： (1)對數(shù)生長期的S09733-1菌體細胞表面可發(fā)出綠色熒光，表明其復合體存在于對數(shù)生長期細胞表面并與細胞結(jié)

12、合； (2)菌體細胞表面的熒光并不是均勻分布的，這與利用掃描電鏡在菌體細胞表面觀察到的突起結(jié)構(gòu)相吻合； (3)當S09733-1菌體聚集和形成子實體后，聚集后的細胞和成熟子實體內(nèi)的粘孢子都未檢測到熒光信號，表明該時期的細胞表面已不存在相關(guān)的降解酶類。 (4)由于培養(yǎng)使用的M26培養(yǎng)基中不含有纖維素成分，表明S09733-1的纖維素降解酶類可能是組成型表達。 利用蛋白質(zhì)組學的研究思路，運用雙向凝膠電泳技術(shù)

13、對S09733-1降解纖維素多酶復合體的組成進行了分析。雙向電泳(17cmxl7cm的聚丙烯酰胺凝膠)分離結(jié)果顯示，復合體呈現(xiàn)出30-40個清晰的蛋白點，分子量從10KDa到IOOKDa以上，等電點主要集中在偏酸性范圍，偏堿性區(qū)域蛋白點很少。這一結(jié)果證實了復合體是由多個不同類型的蛋白組分構(gòu)成，呈現(xiàn)出組分的多樣性。將其中30個蛋白點進行摳點和膠內(nèi)酶解，用MALDI-TOF MS技術(shù)對其進行了肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)分析，得到了21個有意義

14、的質(zhì)譜圖譜，其中1個蛋白組分被初步鑒定為內(nèi)切葡聚糖酶。由于堆囊菌的特殊性，其他20個蛋白樣品沒有檢索到完全可信的結(jié)果，但在其各自的匹配蛋白列表中，有多種纖維素降解相關(guān)的酶類處于相對較高的得分。所以，我們正在進行的工作是希望通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)得到蛋白點的肽段序列信息，通過序列檢索或者結(jié)合分子生物學方法對相應蛋白質(zhì)進行準確的鑒定。 本文的結(jié)果不但首次對于纖維堆囊菌降解纖維素類物質(zhì)的基本特性進行了較為全面的表征，而且證明了其纖維素降解酶