膜結(jié)晶法結(jié)晶蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展和表達(dá)體系的完善，已知的蛋白質(zhì)數(shù)目有了很大增長。X射線衍射是確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的最有效方法，而X射線結(jié)晶學(xué)的應(yīng)用要求大分子晶體具有足夠大的尺寸(大于0.1mm)和完美的質(zhì)量，以獲得精確的衍射數(shù)據(jù)。然而，許多生物大分子晶體常常難以成長，一般小分子結(jié)晶的方法都不適合于大分子的晶體生長。因此，獲得質(zhì)量完美的蛋白質(zhì)晶體成為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的主要瓶頸，需要探索新的結(jié)晶方法以制備蛋白質(zhì)等生物大分子晶體。用膜結(jié)晶技術(shù)結(jié)晶蛋白質(zhì)可得到

2、適合于衍射分析的大分子蛋白質(zhì)晶體。
　　 本文首先用滲透膜結(jié)晶法進(jìn)行了幾種蛋白質(zhì)(溶菌酶、木瓜蛋白酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白以及脂肪酶)的膜結(jié)晶，研究了操作條件對蛋白質(zhì)滲透膜結(jié)晶過程的影響，優(yōu)化了幾種蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件，評價(jià)了不同結(jié)晶條件下的溶劑跨膜通量，探討了沉淀劑和添加劑對蛋白質(zhì)滲透膜結(jié)晶的作用機(jī)理，并對最后得到的蛋白質(zhì)晶體進(jìn)行了初步分析。研究結(jié)果表明：
　　 對于溶菌酶的滲透膜結(jié)晶過程，氯化鈉和硫氰酸鈉為溶菌酶滲透膜

3、結(jié)晶的有效沉淀劑。結(jié)晶溶液中加入一定添加劑如丙三醇、PEG4000或PEG6000等，可以有效提高溶劑跨膜通量，改善晶體質(zhì)量，促進(jìn)晶體成核及生長，得到質(zhì)量更完美的晶體。
　　 對于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結(jié)晶，溶菌酶濃度對溶菌酶的動態(tài)滲透膜結(jié)晶過程有重要影響。過高的溶菌酶濃度使得結(jié)晶溶液中出現(xiàn)大量粒狀沉淀，晶體質(zhì)量和產(chǎn)率下降，溶劑跨膜通量較低；然而溶菌酶濃度太低，結(jié)晶時(shí)間較長。一般來說，溶劑跨膜通量隨著蛋白質(zhì)濃度的升高而降低。在研究的

4、溶菌酶濃度范圍內(nèi)，20～30mg/mL，尤其是20mg/mL的溶菌酶濃度，更適合于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結(jié)晶，在此濃度下，能有效控制結(jié)晶溶液中晶核的數(shù)量，得到的晶體尺寸較大，并且結(jié)晶時(shí)間不至太長。
　　 沉淀劑氯化鈉濃度對溶菌酶的動態(tài)滲透膜結(jié)晶過程也有重要影響。將沉淀劑濃度從4％提高到6.5％(wt/vol)，結(jié)晶誘導(dǎo)時(shí)間縮短；進(jìn)一步升高沉淀劑濃度到9％，則又使得結(jié)晶誘導(dǎo)時(shí)間延長，溶劑跨膜通量降低。當(dāng)沉淀劑濃度大于9％時(shí)，結(jié)晶溶液中

5、出現(xiàn)大量沉淀。對于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結(jié)晶，4～6.5％的沉淀劑濃度是最佳的沉淀劑濃度范圍。對于20mg/mL的溶菌酶，在4％的氯化鈉濃度下，洗脫液氯化鎂濃度和流速分別為25％和4319um/s，結(jié)晶溶液的最佳流速為288μm/s。
　　 對于洗脫液濃度和流速對溶菌酶動態(tài)滲透膜結(jié)晶的影響，當(dāng)氯化鎂溶液流速在2880～4319μm/s范圍內(nèi)時(shí)，制備了質(zhì)量完美的溶菌酶晶體。對于洗脫液濃度，溶劑跨膜通量隨洗脫液濃度的升高而增長。然而，過

6、高的洗脫液濃度影響最終得到的晶體質(zhì)量，在較高的洗脫液濃度下，晶體數(shù)量增多，但晶體尺寸減小。對于20mg/mL的溶菌酶，在4％的氯化鈉濃度下，洗脫夜流速為4319μm/s，進(jìn)料液流速為288μm/s時(shí)，洗脫液濃度控制在20～25％范圍內(nèi)更適合于溶菌酶的動態(tài)滲透膜結(jié)晶。
　　 對于溶液pH值和離子強(qiáng)度對溶菌酶動態(tài)滲透膜結(jié)晶的影響，在相同pH值下，離子強(qiáng)度越高，溶劑跨膜通量越大。晶體的晶形主要受溶液pH值的影響，離子強(qiáng)度則主要影響溶劑

7、跨膜通量。在不同pH值下得到了不同晶形的晶體，提高結(jié)晶溶液的pH值，晶體從四角晶系向正交晶系過渡。研究發(fā)現(xiàn)，以pH4.7的醋酸鈉為緩沖溶液時(shí)制備了四角晶系和正交晶系的晶體，而以pH6.5和pH8.3的磷酸鹽以及pH8.3的Tris-HCl為緩沖溶液時(shí)僅得到正交晶系的晶體。正交晶系的生長速度高于四角晶系。晶體從四角晶系向正交晶系的過渡與溫度以及蛋白質(zhì)濃度有關(guān)。另外，晶形也是pH值和沉淀劑濃度的函數(shù)。
　　 對于結(jié)晶誘導(dǎo)時(shí)間，在4％

8、和6.5％的沉淀劑濃度下，尤其是4％氯化鈉，結(jié)晶溶液中的溶菌酶濃度隨著時(shí)間的推移而增大；而在9％的氯化鈉下，結(jié)晶溶液中的溶菌酶濃度隨著時(shí)間的推移而減小。氯化鈉濃度對溶菌酶動態(tài)滲透膜結(jié)晶的影響可歸因于對溶菌酶溶解度和溶劑活度雙重作用的結(jié)果。其他條件相同時(shí)，在研究的氯化鈉濃度范圍內(nèi)(4～9％)，6.5％氯化鈉濃度下的結(jié)晶誘導(dǎo)時(shí)間最短，4％氯化鈉下的結(jié)晶誘導(dǎo)時(shí)間最長。
　　 對于木瓜蛋白酶的靜態(tài)滲透膜結(jié)晶，硫酸銨和磷酸鈉均可作為結(jié)晶過

9、程的優(yōu)良沉淀劑。在17℃時(shí)，以pH4.7的醋酸鹽緩沖溶液為溶劑，在這兩種沉淀劑的適當(dāng)濃度范圍內(nèi)(Na3PO4:4～7％;(NH4)2SO4:4～10％)，均制備了質(zhì)量完美的木瓜蛋白酶晶體。通過監(jiān)控結(jié)晶溶液中木瓜蛋白酶濃度隨時(shí)間的變化，發(fā)現(xiàn)磷酸鈉為沉淀劑進(jìn)行木瓜蛋白酶的靜態(tài)滲透膜結(jié)晶，在較低木瓜酶濃度下更容易獲得質(zhì)量完美的木瓜蛋白酶晶體。添加劑PEG600和PEG4000的加入，使得木瓜蛋白酶更容易從溶液中結(jié)晶出來，誘導(dǎo)時(shí)間縮短，形成質(zhì)量

10、更好的木瓜酶晶體。晶體尺寸分布表明，實(shí)驗(yàn)制備的蛋白質(zhì)晶體滿足衍射分析的需要。
　　 此外，還研究了幾種蛋白質(zhì)(卵清蛋白、牛血清白蛋白、脂肪酶)的靜態(tài)滲透膜結(jié)晶。對于卵清蛋白的滲透膜結(jié)晶，在30mg/mL卵清蛋白濃度下，以pH7.3的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，3～7％的PEG6000為沉淀劑，20％MgCl2為洗脫液，實(shí)驗(yàn)制備了形狀較好，尺寸較大的卵清蛋白晶體；對于牛血清白蛋白的滲透膜結(jié)晶，在16～25℃范圍內(nèi)，以pH6.3的磷酸鹽為

11、緩沖溶液時(shí)，氯化鈉、PEG600和PEG6000可作為牛血清白蛋白滲透膜結(jié)晶的有效沉淀劑。結(jié)晶溶液中加入添加劑聚乙二醇類或DMSO可以有效提高溶劑跨膜通量，增大晶體尺寸；對于脂肪酶的滲透膜結(jié)晶，以pH6.3的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，硫氰酸鈉、丙三醇、PEG400或PEG600為沉淀劑時(shí)，實(shí)驗(yàn)制備了脂肪酶晶體，其中以丙三醇為沉淀劑制備的晶體質(zhì)量最好。
　　 最后，又研究了溶菌酶的真空膜結(jié)晶，以pH4.7的醋酸鹽緩沖溶液為溶劑，溶菌酶