ZFP580調(diào)控eNOS-NO信號通路促進EPCs分化的分子機制研究.pdf

1、目的：內(nèi)皮功能紊亂是心腦血管病重要的病生理基礎(chǔ)。加速血管損傷后再內(nèi)皮化和血管新生，是預(yù)防及治療心血管病的關(guān)鍵。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)參與血管內(nèi)皮修復(fù)及血管新生，EPCs的歸巢、增殖及分化受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響，其機制尚未闡明。本實驗旨在研究新型C2H2鋅指蛋白基因ZFP580調(diào)控EPCs分化的分子機制，為深入研究ZFP580的生物學(xué)功能提供實驗依據(jù)，為治療血管性疾病提供新

2、的治療策略和靶點。
　　方法：①密度梯度離心法，分離培養(yǎng)大鼠骨髓源性EPCs，免疫熒光染色及流式細胞技術(shù)(FACS)鑒定EPCs；②體外誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs，觀察EPCs在0 d、4 d、7 d、14 d細胞形態(tài)的動態(tài)改變；免疫熒光染色檢測eNOS在相應(yīng)時間點的表達變化；流式細胞技術(shù)檢測EPCs分化表面分子標記物的動態(tài)改變；QPCR及Western blot檢測相應(yīng)時間點ZFP580 mRNA和蛋白表達水平的變化；③腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得

3、過（低）表達ZFP580的EPCs，QPCR、Western blot、流式細胞技術(shù)及體內(nèi)外血管形成實驗等方法檢測 ZFP580對 EPCs分化及血管生成能力的影響；④Ad-ZFP580及Ad-siZFP580轉(zhuǎn)染EPCs，觀察ZFP580對其下游靶基因eNOS表達的影響，應(yīng)用eNOS抑制劑L-NAME，探討eNOS/NO信號通路在ZFP580介導(dǎo)的EPCs分化過程中的作用。
　　結(jié)果：分離培養(yǎng)的EPCs在3~4 d時，光學(xué)顯微鏡

4、下可見部分貼壁細胞集落樣生長，呈圓形或不規(guī)則形；7~10 d，貼壁的梭形細胞從細胞團邊緣出芽生長；14~21 d可觀察到梭形細胞首尾相連成條索狀結(jié)構(gòu)，梭形細胞基本融合，融合后逐漸呈鋪路石狀。細胞培養(yǎng)至7 d時， Dil-acLDL/FITC-UEA-I雙陽性細胞約占87.39±2.98％，免疫熒光及FACS結(jié)果顯示：CD31、CD34和VEGFR-2表達陽性。以上結(jié)果說明所培養(yǎng)細胞是EPCs。FACS檢測EPCs的分子表面標志物的表達變

5、化，結(jié)果顯示：隨著EPCs的分化，干細胞表型CD133逐漸減低，而成熟ECs表型逐漸增高；同時，ZFP580及eNOS在EPCs的分化過程中均呈動態(tài)表達。腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得過（低）表達ZFP580的EPCs，ZFP580過表達促進成熟內(nèi)皮表型CD31、vWF、eNOS的表達，降低干細胞表型CD133的表達，同時，體內(nèi)外血管生成能力增強；而ZFP580低表達抑制成熟內(nèi)皮表型CD31、vWF、eNOS的表達，增強干細胞表型CD133的表達，

6、同時，體內(nèi)外血管生成能力減弱。說明ZFP580可促進EPCs向成熟內(nèi)皮細胞分化。應(yīng)用eNOS抑制劑L-NAME后，顯著降低Ad-ZFP580誘導(dǎo)的EPCs分化作用，且NO的生物利用度明顯減少，說明ZFP580通過eNOS/NO信號途徑調(diào)控EPCs的分化。
　　結(jié)論：ZFP580通過eNOS/NO信號通路調(diào)控EPCs的分化。本實驗在分子、細胞和個體水平上研究ZFP580調(diào)控EPCs分化促進血管內(nèi)皮修復(fù)的分子機制，為深入研究ZFP58