高危型HPV感染及不同級(jí)別宮頸病變女性陰道菌群多樣性分析.pdf

1、宮頸癌是威脅全世界女性健康最為嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均居女性生殖道惡性腫瘤的首位。目前研究已經(jīng)證實(shí)，高危型人乳頭瘤病毒（High-risk human papillomavirus，HR-HPV）的持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及宮頸癌發(fā)生的必要條件。當(dāng)陰道感染HPV病毒后，大多數(shù)女性的陰道微環(huán)境可以自行將病毒清除。只有少數(shù)女性的HPV病毒可以長(zhǎng)時(shí)間存在

2、于陰道微環(huán)境中，經(jīng)過5-10年的時(shí)間，最終發(fā)展為CIN及癌變。因此，在這個(gè)過程中可能還有其它致癌因素或協(xié)同HPV作用的因素存在，導(dǎo)致宮頸感染HPV的易感性增加，HPV感染得以持續(xù)存在，最終導(dǎo)致癌變發(fā)生。
　　陰道菌群作為維護(hù)陰道微環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，其在HR-HPV持續(xù)感染過程中是否扮演一定作用一直被人們所關(guān)注，不同研究的結(jié)果也不盡相同。陰道微生物研究的關(guān)鍵在于陰道菌群的鑒定，早期的研究主要建立在傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上。女性的生殖道

3、是一個(gè)相對(duì)密閉的環(huán)境，陰道微生物以厭氧菌為主，培養(yǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)需求要求嚴(yán)苛，導(dǎo)致目前很大一部分細(xì)菌仍然無法分離培養(yǎng)及鑒定，因此使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)依賴方法難以全面的認(rèn)識(shí)陰道微生物的群落結(jié)構(gòu)。近年來，隨著非培養(yǎng)依賴的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，如熒光原位雜交、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，使人們對(duì)陰道菌群的認(rèn)識(shí)取得了突破性進(jìn)展。但是這些較傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)仍然具有

4、其局限性，不僅研究工作量大、所需時(shí)間長(zhǎng)，且不能完整的反映整個(gè)微環(huán)境中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)信息，甚至存在重要信息缺失的可能。
　　Barcoded Paired-End Illumina Sequencing(BIPES)法是基于Illumina Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)，結(jié)合16S rRNA標(biāo)簽序列分析微生物群落的新一代測(cè)序方法，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、重現(xiàn)性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，能簡(jiǎn)便、快捷的獲得系統(tǒng)的、結(jié)構(gòu)化的、全面的菌群信息。本研究利用

5、這一新的測(cè)序方法，對(duì)HR-HPV感染女性和健康女性的陰道菌群進(jìn)行檢測(cè)，更加準(zhǔn)確及全面的認(rèn)識(shí)HR-HPV感染女性與健康女性陰道菌群物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)，探討HR-HPV感染與陰道菌群之間的關(guān)系。同時(shí)，通過對(duì)不同級(jí)別宮頸病變女性的陰道菌群進(jìn)行分析，了解不同級(jí)別宮頸病變女性陰道微生物的分布特征、群落結(jié)構(gòu)及宮頸病變發(fā)生發(fā)展中各微生物種群的動(dòng)態(tài)變化，以期為進(jìn)一步研究宮頸病變的病因、發(fā)生發(fā)展過程中陰道微生態(tài)療法及益生菌制劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

6、>　　研究目的:
　　1.借助Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)及BIPES的序列研究方法，分析HR-HPV感染女性和健康女性陰道微生物的菌群構(gòu)成及其多樣性，比較HR-HPV感染女性和健康女性陰道菌群的差異，探索HR-HPV感染與陰道菌群的關(guān)系。
　　2.通過對(duì)不同級(jí)別宮頸病變女性的陰道菌群進(jìn)行分析，了解宮頸病變不同階段的陰道微生物分布特征及群落結(jié)構(gòu)，追蹤宮頸病變發(fā)生發(fā)展過程中各微生物種群的動(dòng)態(tài)變化，探尋陰道菌群的動(dòng)態(tài)變化與宮頸

7、病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
　　研究方法:
　　第一章:
　　1.研究對(duì)象
　　選取2014年9月至2015年9月間于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科健康體檢或診治的女性，根據(jù)HR-HPV篩查(hC2法)結(jié)果分為2組:①HPV陰性組（HPV-組）33例:均為健康體檢者，HR-HPV檢查均陰性;②HPV陽(yáng)性組(HPV+組)98例:HR-HPV均陽(yáng)性。
　　納入標(biāo)準(zhǔn):年齡21-65歲;有性生活史3年及以上;非月經(jīng)期、妊娠期

8、及產(chǎn)褥期婦女。排除標(biāo)準(zhǔn):年齡＞65歲;無性生活史者;合并免疫缺陷疾病者;合并全身系統(tǒng)性疾病者:糖尿病、激素治療性疾?。甭阅I炎等）等。同時(shí)需滿足以下條件:48h內(nèi)無陰道沖洗;3d內(nèi)無性生活史、陰道放藥史;1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)性使用抗生素或抗真菌藥。
　　2.標(biāo)本采集:以無菌棉拭子于陰道穹窿或陰道中段側(cè)壁處留取分泌物，用于16S rRNA基因提取。
　　3.總DNA提取:采用陰道拭子基因組DNA試劑盒提取樣本總DNA，具體步驟參考

9、說明書。DNA提取后置于-20℃冰箱保存。
　　4.16S rRNA-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增及Illumina測(cè)序:以提取的DNA為模板，擴(kuò)增其16S rRNA V4區(qū)的基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外熒光定量后，以相等的終濃度將PCR產(chǎn)物混合均勻，送至深圳華大基因進(jìn)行雙末端100bp測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq2000。
　　5.對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)以BIPES程序進(jìn)行預(yù)處理。通過兩階段聚類（Two-sta

10、ge-clustering，TSC）的分析方法提取出每個(gè)操作分類單元(operationaltaxonomy units，OTU)的代表序列，然后再利用GAST對(duì)OTU進(jìn)行歸類，用于樣品間的相似性分析，主要包括Alpha多樣性、Beta多樣性及菌群結(jié)構(gòu)分析。通過linear discriminant analysis(LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在線分析工具分析兩組間

11、陰道菌群群落結(jié)構(gòu)及菌屬差異。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組計(jì)量資料間的比較采用兩獨(dú)立樣品的t檢驗(yàn)，對(duì)多樣性指數(shù)應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二章
　　1.研究對(duì)象
　　選取2014年9月至2015年9月間于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科健康體檢或診治的女性，根據(jù)宮頸液基細(xì)胞學(xué)、HR-HPV篩查(hC2法)和宮頸活檢病理結(jié)果分為4組:

12、①正常組（N組）33例:均為健康體檢者，宮頸細(xì)胞學(xué)及HR-HPV檢查均陰性;②低級(jí)別組（L組）26例:HR-HPV檢查陽(yáng)性;和/或?qū)m頸活組織檢查確診為低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變;③高級(jí)別組(H組)40例:HR-HPV檢查陽(yáng)性，宮頸活組織檢查確診為高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變;④宮頸癌組（C組）32例:HR-HPV檢查陽(yáng)性，宮頸活組織檢查確診為宮頸癌。
　　納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)與“第一章”相同。
　　標(biāo)本采集、總DNA提取、PCR擴(kuò)增、PCR

13、產(chǎn)物測(cè)序和數(shù)據(jù)處理與“第一章”相同。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)多組間的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)、LSD兩兩檢驗(yàn)，余與“第一章”相同。
　　研究結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一
　　1.本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣品數(shù)131個(gè)，共獲得971007條序列，平均每個(gè)樣品7412條。
　　2.采用PD_ whole_ tree(PD)和Shannon兩個(gè)多樣性指數(shù)來比較HPV-組和HPV+組陰道菌群Alpha多樣性的差異。結(jié)果顯示HPV

14、+組的PD指數(shù)和Shannon指數(shù)均增高，且兩組間Shannon指數(shù)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　3.在菌屬水平上，HPV-組以乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，占81.54％。HPV+組的菌群結(jié)構(gòu)呈多樣性改變，乳酸桿菌屬含量顯著下降，僅占40.48％，同時(shí)加德納菌屬相對(duì)豐度顯著增加，由3.01％增加至19.87％。普氏菌屬、奇異菌屬、消化鏈球菌屬等多種厭氧菌屬和脲原體屬、支原體屬相對(duì)豐度也增加。
　　4.利用QIIME軟

15、件進(jìn)行兩組間的Beta多樣性分析顯示，兩組陰道微生物的總體菌群結(jié)構(gòu)在Weighted_unifrac距離的聚類結(jié)果可顯著的區(qū)分為2個(gè)不同的部分。
　　5.通過LEfSe分析兩組間差異菌屬發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬在HPV-組中富集，而加德納菌屬、普氏菌屬、奇異菌屬、厭氧球菌屬、擬桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬等厭氧菌屬在陽(yáng)性組中富集，且于HPV+組中檢測(cè)到布魯氏菌屬的存在。
　　實(shí)驗(yàn)二
　　1.本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣品數(shù)131個(gè)，共獲得971007條

16、序列，平均每個(gè)樣品7412條。
　　2.采用PD_ whole_tree(PD)和Shannon兩個(gè)多樣性指數(shù)對(duì)四組陰道菌群的Alpha多樣性進(jìn)行分析。隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展，陰道微生物的Alpha多樣性逐漸增加，菌群的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，且于宮頸癌組患者中陰道微生態(tài)改變達(dá)最大化。
　　3.在屬水平上，隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展，乳酸桿菌屬相對(duì)豐度逐漸下降;加德納菌屬的比例先驟增而后逐漸降低;大量低豐度、未知菌屬的含量逐漸增加

17、;多種厭氧菌屬所占比例也有不同程度的增加。
　　4.通過LEfSe進(jìn)行各組間差異菌屬分析發(fā)現(xiàn)，加德納菌屬、支原體屬、脲原體屬主要在低級(jí)別組富集，高級(jí)別組和宮頸癌組主要富集多種厭氧菌屬。
　　5.四組陰道菌群的總體結(jié)構(gòu)在Weighted_unifrac距離的聚類結(jié)果有差異。隨著宮頸病變的發(fā)生發(fā)展，與正常組的距離逐漸拉開，直至顯著的區(qū)分為2個(gè)不同的部分。相鄰兩組間的陰道微生物存在某些相似的菌群構(gòu)成，但同時(shí)具有相互分開的趨勢(shì)。