海灣扇貝和海紫雜交扇貝對(duì)鰻弧菌感染應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄譜分析.pdf

1、海灣扇貝屬瓣鰓綱，異柱目，扇貝科，扇貝屬，在我國(guó)海水養(yǎng)殖中占有重要地位，為山東、河北、遼寧等各省藍(lán)色海洋經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用，但最近這幾年在扇貝育苗期間及外塘保苗過(guò)程中大量使用抗生素和農(nóng)藥，其勢(shì)必導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的提高，加之養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，病害對(duì)扇貝造成的死亡問(wèn)題日益突出，目前來(lái)看培育能夠抵抗外界病原侵襲的扇貝新品種是解決我國(guó)扇貝健康養(yǎng)殖的一條重要途徑。
　　本文以海灣扇貝和海紫雜交扇貝為研究對(duì)象，用不同濃度的溶藻弧菌、哈

2、氏弧菌、鰻弧菌3種類型的弧菌侵染這兩種扇貝，通過(guò)累積死亡率的分析，選取1種對(duì)扇貝較為敏感的弧菌，并為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序取樣實(shí)驗(yàn)確定適宜的注射濃度和取樣時(shí)間點(diǎn)，取樣后進(jìn)行高通量測(cè)序分析。本研究通過(guò)比較海紫雜交扇貝與海灣扇貝自交一代扇貝在弧菌感染后抗病性上的差異來(lái)鑒定抗病相關(guān)基因和分子標(biāo)記，并通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)差異表達(dá)基因和分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定分析，為這兩種扇貝的功能基因組學(xué)和遺傳育種研究提供基礎(chǔ)和幫助。
　　弧菌感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，

3、海灣扇貝和海紫雜交扇貝在經(jīng)過(guò)濃度為1×106、1×107、5×107、1×108CFU/ml溶藻弧菌菌液感染后，在第7天的累積死亡率分別是3.33％、0.00%；6.67%、1.11%；17.78%、7.38%；18.89%、5.56%。注射對(duì)應(yīng)相同濃度的哈氏弧菌菌液感染后，在第7天的累積死亡率分別是11.11%、3.33%；3.33%、1.11%；14.44%、13.33%；18.89%、7.78%。注射對(duì)應(yīng)相同濃度的鰻弧菌菌液感染后

4、，在第7天的累積死亡率分別是7.78%、3.33%；4.44%、1.11%；36.67%、8.89%；66.67%、37.78%。對(duì)照組海灣扇貝和海紫雜交扇貝注射 PBS緩沖液經(jīng)過(guò)7天的累積死亡率分別為6.67%、5%。
　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察，扇貝的累積死亡率隨菌液濃度升高而增加，在相同的濃度下用鰻弧菌感染海灣扇貝和海紫雜交扇貝的死亡率要高于溶藻弧菌和哈氏弧菌，尤其在高濃度菌液侵染下對(duì)兩種扇貝造成的死亡率更為顯著，而哈氏弧菌的毒性稍大

5、于溶藻弧菌。在相同的濃度的溶藻弧菌、哈氏弧菌、鰻弧菌菌液侵染中，海紫雜交扇貝的死亡率要顯著低于海灣扇貝的死亡率，因此海紫雜交扇貝比海灣扇貝在對(duì)弧菌感染的抵抗防御方面表現(xiàn)出良好的雜交優(yōu)勢(shì)。根據(jù)海灣扇貝和海紫雜交扇貝在注射弧菌菌液后死亡率的統(tǒng)計(jì)分析，選擇濃度為1.5×107CFU/ml的鰻弧菌作為測(cè)序取樣時(shí)注射海灣扇貝和海紫雜交扇貝的菌種，并設(shè)置0h，12h作為取樣點(diǎn)，分別取肝胰腺和腎臟樣品用下一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
　　本研究

6、通過(guò)Illumia Hiseq2500技術(shù)，對(duì)海灣扇貝和海紫雜交扇貝感染鰻弧菌前后的肝胰腺和腎臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)篩選掉短序列共獲得了512,745,722條高質(zhì)量序列，用拼接軟件Trinity對(duì)所得序列進(jìn)行從頭組裝，共獲得412,732條轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度827 bp，N50長(zhǎng)度為1511 bp。其中獲得海灣扇貝235,625條轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度1000 bp，N50分別為2002 bp；海紫雜交扇貝306,643條轉(zhuǎn)錄本，平均長(zhǎng)度90

7、1 bp，N50為1724 bp。通過(guò)BLAST比對(duì)進(jìn)行基因功能注釋：23,715、25,230條unigenes分別被注釋到UniProt和NR數(shù)據(jù)庫(kù)中。
　　鰻弧菌侵染后，在海灣扇貝的肝胰腺中，差異表達(dá)的基因有473個(gè)，其中上調(diào)的基因有214個(gè)，下調(diào)的基因有259個(gè)；而海紫雜交扇貝的肝胰腺中，差異表達(dá)的基因有1116個(gè)，其中上調(diào)的基因有594個(gè)，下調(diào)的基因有522個(gè)；在海灣扇貝的腎臟中，差異表達(dá)的基因有243個(gè)，其中上調(diào)的基因

8、有243個(gè)，下調(diào)的基因有181個(gè)；而海紫雜交扇貝的肝胰腺中，差異表達(dá)的基因有398個(gè)，其中上調(diào)的基因有192個(gè)，下調(diào)的基因有206個(gè)。對(duì)海灣扇貝和海紫雜交扇貝相同組織差異表達(dá)分析，以海灣扇貝作為參考，在海灣扇貝和海紫雜交扇貝肝胰腺中，差異表達(dá)的基因共有596個(gè)，其中上調(diào)的基因有311個(gè)，下調(diào)的基因有285個(gè)；而在腎臟中，差異表達(dá)的基因有482個(gè)，其中上調(diào)的基因有187個(gè)，下調(diào)的基因有295個(gè)。
　　依據(jù)差異表達(dá)基因的GO富集分析，