小鼠胚胎體外培養(yǎng)方法的改良.pdf

1、盡管早期胚胎體外操作有一定的研究進(jìn)展，然而體外培養(yǎng)的胚胎質(zhì)量仍然較低，其著床與妊娠率仍然低于體內(nèi)正常發(fā)育的胚胎，我們建立一種動(dòng)態(tài)的微環(huán)境胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)將模擬胚胎體內(nèi)發(fā)育的纖毛擺動(dòng)與輸卵管收縮的機(jī)械刺激與微小的生化環(huán)境以改進(jìn)胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)以進(jìn)一步提高胚胎質(zhì)量與發(fā)育潛能。
　　采用內(nèi)徑0.21 mm、外徑0.28 mm的塑料毛細(xì)管培養(yǎng)胚胎，將吸有胚胎的毛細(xì)管浸在盛有蒸餾水的燒杯內(nèi)，再將燒杯放置在培養(yǎng)箱里的磁力攪拌器上，允許胚胎在微小的空間

2、內(nèi)發(fā)育并伴隨著水的旋轉(zhuǎn)而擺動(dòng)，更好地模擬了胚胎在輸卵管中的運(yùn)動(dòng)環(huán)境。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證表明毛細(xì)管規(guī)格為34 G，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為180r/min時(shí)，效果最佳。
　　1)分別對(duì)85枚、82枚2-細(xì)胞胚胎進(jìn)行毛細(xì)管及微滴培養(yǎng)，其中毛細(xì)管培養(yǎng)胚胎的囊胚率以及胚胎細(xì)胞數(shù)(85.4％，57.0)顯著高于微滴培養(yǎng)(36.5％，20.6)，囊胚率差異顯著(P＜0.05）。且接種在Matrigel基底膜上形成的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)集落顯著增大;2）毛細(xì)管

3、培養(yǎng)的胚胎，將1-細(xì)胞胚胎、2-細(xì)胞胚胎用毛細(xì)管培養(yǎng)法培養(yǎng)至囊胚階段(E3.5d)用非手術(shù)法移植到3.5d的假孕鼠體內(nèi)，正常體內(nèi)發(fā)育的胚胎(E3.5 d)取出后，用非手術(shù)法移植到3.5 d的假孕鼠體內(nèi)。10.5 d后剖腹產(chǎn)，結(jié)果表明毛細(xì)管培養(yǎng)的胚胎與體內(nèi)正常發(fā)育的胚胎同期發(fā)育，差異不顯著(P＞0.05);3）嵌合體的制備，采用無(wú)GFP標(biāo)記的恒河猴胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)樣干細(xì)胞，注射到毛細(xì)管培養(yǎng)與微滴培養(yǎng)獲得的8-細(xì)胞/囊胚中，胚胎移植到2.5 d

4、的假孕鼠體內(nèi)，E13-E14 d后進(jìn)行小鼠全胚免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)管培養(yǎng)的嵌合率(37/83)要明顯高于微滴培養(yǎng)的胚胎(28/79)，嵌合比例差異顯著(P＜0.05）;此外采用有GFP標(biāo)記的恒河猴胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)樣干細(xì)胞，注射到二細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)其進(jìn)行毛細(xì)管培養(yǎng)，培養(yǎng)至八細(xì)胞期/囊胚期(E3.5 d)，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，毛細(xì)管培養(yǎng)支持胚胎嵌合。
　　小鼠胚胎體外培養(yǎng)方法的改良——毛細(xì)管培養(yǎng)，促進(jìn)小鼠植入前胚胎的體外發(fā)育。優(yōu)于