阿托伐他汀聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注對(duì)大鼠腎臟缺血-再灌注損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠腎臟缺血/再灌注損傷的最佳途徑及最佳劑量的研究
　　目的:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)治療對(duì)大鼠腎臟缺血/再灌注損傷（I/R）有潛在修復(fù)作用，輸注后歸巢率低等因素限制了其功能的發(fā)揮。已有研究證實(shí)，細(xì)胞的輸注途徑在一定程度上能影響MSC的歸巢率。目前常用的輸注途徑為尾靜脈和頸動(dòng)脈。本研究采用腎動(dòng)脈直接注射途徑，并比較MSC不同輸注途徑和不同輸注劑量對(duì)細(xì)胞腎臟

2、歸巢率的影響以及對(duì)損傷腎臟的修復(fù)作用，進(jìn)而探討MSC治療腎臟I/R損傷的最佳途徑和劑量。
　　方法:實(shí)驗(yàn)采用8-9周齡的雄性SD大鼠。通過(guò)切除右側(cè)腎臟后，立即用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂45分鐘后再開(kāi)放的方法建立大鼠腎臟I/R模型?；謴?fù)再灌注后，將大鼠隨機(jī)分為干預(yù)組(n=60)和對(duì)照組(n=6)。干預(yù)組根據(jù)MSC的輸注途徑不同，分為尾靜脈(TV)組，頸動(dòng)脈(CA)組和腎動(dòng)脈(RA)組。根據(jù)MSC輸注劑量不同，將上述3小組再次分為10

3、個(gè)亞小組（n=6/亞小組）:(1)TV組:1×106;(2)CA組:1×106，5×105，1×105和5×104;(3)RA組:1×106，5×105，1×105，5×104和PBS。CM-Dil標(biāo)記的MSC細(xì)胞重懸于500μl的PBS中，于恢復(fù)再灌注1小時(shí)內(nèi)緩慢輸入體內(nèi)。再灌注后1小時(shí)和24小時(shí)，彩色多普勒超聲評(píng)估腎臟血流。以再灌注后24小時(shí)為時(shí)間點(diǎn)，處死大鼠并留取相應(yīng)的標(biāo)本:檢測(cè)血清肌酐水平(Scr)以評(píng)估腎功能;腎組織切片進(jìn)行H

4、E染色評(píng)估腎臟損傷病理評(píng)分;熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察輸注MSC在腎臟及其他臟器的定植情況。
　　結(jié)果:(1)再灌注后24小時(shí)，對(duì)照組的腎臟損傷嚴(yán)重:病理評(píng)分達(dá)3.30±0.65;Scr為5.22±0.43mg/dl，明顯高于正常組（0.92±0.14mg/dl，P＜0.05）。輸注相同劑量的MSC(1×106)后，CA組的MSC均勻分布在全身多個(gè)臟器且對(duì)損傷腎臟的修復(fù)作用最明顯:與對(duì)照組相比，Scr降至4.48±0.95mg/

5、dl（P＜0.05），腎臟病理評(píng)分降至2.85±0.76（P＜0.05）。TV組的MSC主要阻斷在肺，腎臟的歸巢數(shù)量較少;Scr和病理評(píng)分較對(duì)照組減低，但兩組之間差異不顯著。在RA組，輸注的MSC絕大多數(shù)定植在腎臟且腎臟中的歸巢遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TV組和CA組，但是腎功能卻較對(duì)照組進(jìn)一步惡化（Scr,6.51±0.58mg/dl）。(2)當(dāng)輸注MSC細(xì)胞在5×104-1×106之間時(shí)，比較CA組各亞組發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)量與治療效果成正比，最佳治療組在C

6、A組(1×106);比較RA組各亞組發(fā)現(xiàn)，輸注MSC的細(xì)胞數(shù)量與治療效能成U型分布，最佳治療效果在RA組(1×105):Scr為3.71±0.96mg/dl，病理評(píng)分為2.65±0.56且RA組的最佳治療組-RA組(1×105)治療效能更優(yōu)于CA組的最佳治療組-CA組(1×106)。(3)共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)在RA組(1×106)，大量MSC堆積在腎小球內(nèi);隨著細(xì)胞劑量下降，MSC在腎臟定植量也降低。超聲檢查發(fā)現(xiàn)腎小球內(nèi)定植

7、的細(xì)胞量與腎臟血流灌注呈正相關(guān):輸注過(guò)量細(xì)胞會(huì)堵塞腎小球，導(dǎo)致腎臟低灌注。
　　結(jié)論:細(xì)胞輸注途徑和劑量是影響MSC治療I/R效能的重要因素。本研究得出，經(jīng)腎動(dòng)脈注射MSC是提高輸注MSC歸巢的最佳輸注途徑，1×105是腎動(dòng)脈注射。的最佳治療劑量。該組合既能改善療效，又可節(jié)省干細(xì)胞。過(guò)多的細(xì)胞輸注會(huì)影響腎臟血流，加重腎臟損傷。
　　第二部分 阿托伐他汀聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注對(duì)大鼠腎臟缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制研究

8、　　目的:腎臟缺血/再灌注損傷（I/R）后，腎組織內(nèi)存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)等腎臟微環(huán)境障礙。這是導(dǎo)致移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)存活率低的重要原因，也極大地降低了MSC對(duì)腎臟I/R損傷的治療作用。已有研究證明，他汀類藥物能改善腎臟I/R損傷后的內(nèi)部微環(huán)境。本研究旨在觀察阿托伐他汀(Ator)聯(lián)合MSC輸注對(duì)腎臟I/R損傷的作用并探討其可能機(jī)制。
　　方法:7-8周齡的雄性SD大鼠48只。通過(guò)夾閉雙側(cè)腎蒂45分鐘后再開(kāi)放的方法建立大

9、鼠腎臟I/R模型?；謴?fù)再灌注后，即刻通過(guò)左頸動(dòng)脈給動(dòng)物模型輸注CM-Dil標(biāo)記的MSC（1×106/500μl PBS）或單純PBS。以再灌注后24小時(shí)和72小時(shí)作為時(shí)間點(diǎn)，處死大鼠并留取相應(yīng)標(biāo)本。上述動(dòng)物均于術(shù)前3天給予200μlAtor灌胃治療(5mg/kg/d，n=24)或等量PBS(n=24)，且灌胃治療持續(xù)到上述時(shí)間點(diǎn)。根據(jù)動(dòng)物是否接受Ator灌胃治療和MSC輸注治療分為四組（n=6/組/時(shí)間點(diǎn)）:對(duì)照組，Ator組，MSC組

10、和Ator+MSC組。檢測(cè)血清肌酐水平(Scr)，血清尿素氮水平(BUN)以評(píng)估腎功能;腎組織切片進(jìn)行HE染色評(píng)估腎臟損傷病理評(píng)分;TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;免疫組化檢測(cè)腎組織中Ki-67的表達(dá)以明確腎小管增生情況;ELISA檢測(cè)腎組織中TNF-α、IL-1β和IL-10的表達(dá)以評(píng)估炎癥反應(yīng)，檢測(cè)腎組織中MPO、SOD、MDA和GSH的含量評(píng)估氧化應(yīng)激損傷;共聚焦顯微鏡觀察輸注MSC在腎臟的存活率;Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)

11、蛋白(Bax和Bcl-2)、Toll樣受體4(TLR4)和高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)再灌注后24小時(shí)，MSC組Scr、BUN以及腎臟病理評(píng)分均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）;與MSC組相比，Ator+MSC組能進(jìn)一步降低Scr、BUN和損傷評(píng)分(P＜0.05)。再灌注后24小時(shí)，TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MSC組的腎小管上皮細(xì)胞凋亡較對(duì)照組減少;Ator+MSC組比MSC組更顯著地抑制凋亡(P＜0.05)。

12、Western blot檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)情況兩組間的比較與TUNEL結(jié)果類似。再灌注后72小時(shí)，MSC組的腎小管上皮細(xì)胞增生較對(duì)照組明顯增加;Ator+MSC組比MSC組更有效地促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.05）。(2)再灌注后24小時(shí)，免疫熒光檢測(cè)顯示Ator+MSC組腎臟組織切片中CM-Dil陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著高于MSC組（32.33±3.51 vs.22.67±3.79，P＜0.05）。ELISA檢測(cè)顯示

13、Ator+MSC組IGF-1的表達(dá)水平顯著高于MSC組（P＜0.05），VEGF和HGF表達(dá)也呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。(3)與非Ator處理組（對(duì)照組和MSC組）比較，Ator處理組（Ator組和Ator+MSC組）的促炎因子表達(dá)下降（TNF-α:3020.53±907.78 vs.4020.95±1207.28，P＜0.05:IL-1β:985.74±207.19 vs.1210.29±307.79，P＜0.05），抗炎因子表達(dá)增加(IL-1

14、0:542.23±91.25 vs.402.28±72.07，P＜0.05)。檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)的指標(biāo)(MPO、SOD、MDA和GSH)發(fā)現(xiàn)，Ator處理組的MPO活性和MDA濃度較非Ator處理組顯著減少（P＜0.05），GSH水平顯著上升（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ator處理組的腎臟組織中TLR4和HMGB1的表達(dá)較非Ator處理組顯著減少（P＜0.05）。
　　結(jié)論:Ator預(yù)處理能有效減輕腎臟I/R損