阿托伐他汀預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高，心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的主要殺手。長時間的心肌缺血可使組織損傷甚至細胞死亡，解決缺血損傷的關(guān)鍵是冠狀動脈再通，但是長時間的心肌缺血后的再灌注往往會導(dǎo)致更嚴重的損傷，這種現(xiàn)象稱之為心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。缺血再灌注損傷是冠狀動脈再通術(shù)如溶栓、PTCA或搭橋術(shù)后重要的并發(fā)癥。如何既能保證恢復(fù)缺血組織的血流灌注，同時又能減輕I/R損傷的發(fā)生成為了目前研究的熱點問

2、題。
　　 1986年，Murry提出缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)的概念，即在對心肌進行長時間缺血前，先對心肌進行幾次短暫性的缺血，心肌可耐受此后更長時間的缺血現(xiàn)象。然而，由于IPC潛在的危險性及在臨床實際中的不可操控性，使得IPC的臨床應(yīng)用受到局限。隨后研究人員發(fā)現(xiàn)多種藥物可以模擬IPC產(chǎn)生確切的心肌保護效應(yīng)，如:揮發(fā)性麻醉藥七氟烷、阿片類鎮(zhèn)靜藥、他汀類藥物等，即藥物預(yù)處理。由于藥物預(yù)

3、處理可擴大使用范圍，節(jié)省處理時間，更適于臨床應(yīng)用。
　　 他汀類藥物是動脈粥樣硬化治療過程中最重要的藥物。研究表明，長期使用他汀類藥物的患者不僅能改善遠期預(yù)后，還可降低PCI術(shù)后心肌損傷標志物升高的水平。近2年的臨床隨機對照試驗迸一步表明，PCI手術(shù)前24小時給予1次較大劑量的他汀類藥物（無論是否正在應(yīng)用他汀類藥物）可明顯降低PCI術(shù)后心肌損傷標志物的升高。他汀類藥物的這種即時心肌保護作用很可能是通過藥物模擬的缺血預(yù)適應(yīng)實現(xiàn)的，

4、如果這個假設(shè)成立，那么應(yīng)該一個劑量的他汀類藥物即可出現(xiàn)心肌保護效果。在本研究中，我們擬建立在體大鼠I/R、離體大鼠I/R及原代培養(yǎng)心肌細胞氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型，明確單次負荷量阿托伐他汀(atorvastatin，Ator)預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，并進一步探討Ator心肌保護的可能機制。通過以上研究，進一步為Ator防治心肌缺血再灌注損

5、傷提供實驗依據(jù)，并且為臨床心肌保護提供新的治療途徑。
　　 實驗內(nèi)容主要包括以下三部分:
　　 第一部分單次負荷量阿托伐他汀預(yù)處理對在體大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響
　　 目的:
　　 研究單次負荷量阿托伐他汀預(yù)處理是否能夠模擬缺血預(yù)適應(yīng)對在體大鼠心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮心肌保護作用。
　　 方法:
　　 56只健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機分為8組，每組7只，其中每組

6、中1只用于留取心肌組織的電鏡標本。制備阿托伐他汀生理鹽水混懸液(20 mg/ml)，按照80 mg/kg灌胃，每只大鼠約需1.0 ml。
　　 (1)假手術(shù)組（sham組）:等量生理鹽水灌胃，開胸暴露心臟，于左心耳與主動脈之間找到前降支，于距前降支起點2-3 mm處穿線，不結(jié)扎前降支;
　　 (2)缺血再灌注組（I/R組）:等量生理鹽水灌胃，開胸暴露心臟，于前降支近端同一部位處采用套管法完全阻斷前降支血流30min，隨后

7、再恢復(fù)前降支血流灌注120 min;
　　 (3)缺血預(yù)適應(yīng)組（IPC組）:等量生理鹽水灌胃，缺血再灌注前，給予同部位阻斷前降支5 min，復(fù)灌5 min，循環(huán)3次，再次阻斷前降支血流，缺血30 min，復(fù)灌120 min;
　　 (4)阿托伐他汀預(yù)處理組(Ator組):術(shù)前給予Ator80 mg/kg灌胃，分別于灌胃后3h、6h、12h、24 h、48 h時結(jié)扎前降支，缺血30 min，再灌注120 min，最終選取不

8、同時間點中心肌梗死面積最小組作為Ator預(yù)處理組。
　　 本實驗采用在體大鼠心臟開胸暴露冠狀動脈的前降支，并于前降支近端穿線結(jié)扎前降支30 min，再灌注120 min的方法制備在體大鼠I/R模型;采用缺血5 min，復(fù)灌5 min，反復(fù)循環(huán)3次，制備IPC模型。采用伊文思藍(Evans Blue)標記心肌缺血范圍，以2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）標

9、記心肌梗死范圍，并采用面積計算法計算心肌缺血區(qū)和心肌梗死區(qū)的范圍;于再灌注120 min結(jié)束時，于肺動脈取血1-2 ml，離心，光化學(xué)法測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的活性;透射電子顯微鏡觀察不同處理組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)及線粒體損傷程度。
　　 結(jié)果:
　　 1、心電圖ST-T變化情況
　　 I/R組結(jié)扎前降支后心電圖ST段弓背向上抬高，與T波融合，呈墓碑樣改變。Sham組手術(shù)

10、前后心電圖無明顯變化。
　　 2、I/R組與Ator預(yù)處理各組梗死面積的比較
　　 與I/R組相比，Ator6組、Ator12組、Ator24組、Ator48組的心肌梗死面積顯著減少(P＜0.05)，其中Ator12組較Ator48組心肌梗死面積顯著減少（P＜0.05），較Ator6組、Ator24組心肌梗死面積有減少趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;Ator3組的心肌梗死面積與I/R組比較未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.0

11、5)。依據(jù)上述實驗結(jié)果，最終選擇Ator12組作為Ator預(yù)處理組。
　　 3、各組心肌缺血范圍的比較
　　 缺血區(qū)范圍用缺血區(qū)(area at risk)與左心室(left ventricular)面積比來測定。用AAR/LV表示缺血區(qū)與左心室面積比。
　　 與I/R組相比，IPC組、Ator組的缺血區(qū)范圍（AAR/LV）顯著減少(P＜0.05);與IPC組相比，Ator組的缺血范圍有增大趨勢，但未見統(tǒng)計學(xué)差異

12、(P＞0.05)。
　　 4、各組心肌梗死范圍的比較
　　 梗死范圍大小用心肌梗死區(qū)(infarct area)與缺血區(qū)(area at risk)面積比來表示。用IA/AAR表示梗死區(qū)/與缺血區(qū)面積比。
　　 與I/R組相比，IPC組、Ator組的梗死區(qū)范圍(IA/AAR)顯著減少(P＜0.05);IPC組與Ator組的梗死區(qū)范圍相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5、各組LDH活性的比較

13、　　 與I/R組相比，IPC組、Ator組的LDH的活性均顯著下降(P＜0.05);與IPC組相比，Ator組的LDH活性顯著增加(P＜0.05)。
　　 6、各組心肌超微結(jié)構(gòu)的改變
　　 Sham組心肌組織結(jié)構(gòu)及線粒體等超微結(jié)構(gòu)正常，肌原纖維與嵴突排列整齊，線粒體多而密集，糖原顆粒豐富;I/R組肌原纖維重度水腫，結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體腫脹明顯、膜完整性喪失，糖原顆粒減少;IPC組心肌組織較I/R組損傷明顯減輕，肌原纖維腫脹

14、不明顯，肌膜遭到破壞，線粒體結(jié)構(gòu)基本正常且密集分布，嵴突數(shù)目較多，糖原顆粒較豐富;Ator組心肌細胞輕中度水腫，肌膜腫脹較輕，部分肌原纖維及肌絲排列不規(guī)則，線粒體總體結(jié)構(gòu)尚可，輕度水腫，嵴突數(shù)目變少、排列紊亂，糖原顆粒較多。
　　 結(jié)論:
　　 1、單次負荷量Ator（80 mg/kg）預(yù)處理能夠減輕在體大鼠心肌缺血再灌注損傷，其最大保護作用出現(xiàn)于灌胃后12小時左右。
　　 2、在心肌缺血再灌注損傷保護作用方面，

15、單次負荷量Ator預(yù)處理并不優(yōu)于缺血預(yù)適應(yīng)。
　　 第二部分阿托伐他汀預(yù)處理對離體大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護作用及其作用機制研究
　　 目的:
　　 探討阿托伐他汀預(yù)處理對離體大鼠全心缺血再灌注損傷是否具有心肌保護效果及線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP channels)和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochon

16、drial permeability transition pore，mPTP)在其中的作用。
　　 方法:
　　 用K-H緩沖液逆行灌流離體SD大鼠心臟，全心缺血30 min后復(fù)灌120 min建立離體缺血再灌注損傷模型。應(yīng)用mitoKATP通道的阻斷劑5-HD(5-hydroxydecanoic acid)或mPTP的開放劑氯尼達明(lonidamine，LND)，用以評價mitoKATP通道和mPTP在Ator預(yù)處

17、理中的作用。
　　 SD大鼠隨機分為以下7組:
　　 (1) control組:持續(xù)灌流。
　　 (2) I/R組:心臟進行全心缺血30 min，再灌注120 min。
　　 (3) Ator預(yù)處理組:分別于全心缺血前15 min，30 min，60 min或120 min灌流Ator（1μM），確定Ator最佳保護用藥時間;全心缺血前分別給予Ator0.01μM，0.1μM，1μM，10μM灌流30mi

18、n（Ator最佳用藥時間為30 min），確定Ator最佳保護用藥濃度。
　　 (4) Ator+5-HD組:心臟首先灌流5-HD(100μM)20 min，然后全心缺血前預(yù)處理Ator(1μM)30 min。
　　 (5) Ator+LND組:全心缺血前預(yù)處理Ator（1μM）30 min，在再灌注開始時給予LND（30μM）20 min。
　　 (6) 5-HD組:心臟首先灌流5-HD（100μM）20 mi

19、n，然后全心缺血前灌流K-H緩沖液30 min。
　　 (7) LND組:在再灌注開始時給予LND(30μM)20 min。
　　 比較各組間的血流動力學(xué)、心肌梗死面積、冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)活性及心肌組織ATP含量。再灌注20 min后測定心肌煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）含量以反映mPTP的開放情況。透射電子顯微鏡觀察不同處理組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)及線粒體損傷程度。
　　 結(jié)果:
　　 1、M

20、or對缺血再灌注后心肌梗死面積的影響
　　 與I/R組相比，Ator15，Ator30，Ator60明顯減少心肌梗死面積（P＜0.05）。Ator120與I/R組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。與Ator30相比，Ator15，Ator60心肌梗死面積明顯增加（P＜0.05），說明Ator最佳保護作用的用藥時間為30 min。
　　 與I/R組相比，四種不同濃度的Ator預(yù)處理均明顯減少心肌梗死面積（P＜0.05）。其

21、中，1μM的Ator預(yù)處理心肌保護作用最佳。5-HD或LND的聯(lián)合應(yīng)用取消了Ator減少心肌梗死面積的作用（P＜0.05）。與I/R組比較，單獨給予5-HD或LND對心肌梗死面積無明顯影響(P＞0.05)
　　 2、Ator對血流動力學(xué)的影響
　　 7組離體心臟平衡期血流動力學(xué)指標比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。缺血30 min，再灌注120 min后，心功能指標均較平衡期基礎(chǔ)值減退。主要表現(xiàn)在左心室收縮壓(LVSP

22、)，左心室壓力最大變化速率（dp/dtmax，-dp/dtmax）和心率(HR)降低，左心室舒張末壓(LVEDP)升高。Ator（1μM）組血流動力學(xué)的各項指標均優(yōu)于I/R組（P＜0.05）。然而，Ator預(yù)處理對心功能的保護作用可被5-HD或LND完全阻斷。
　　 3、Ator對LDH的影響
　　 與control組相比，I/R組心臟再灌注后冠脈流出液中LDH活性明顯上升(P＜0.05)。Ator預(yù)處理可顯著降低LDH

23、活性，5-HD或LND與Ator聯(lián)合應(yīng)用時，均阻斷了Ator降低LDH的作用。與I/R組比較，單獨給予5-HD或LND對LDH活性無明顯影響(P＞0.05)。
　　 4、Ator對離體心臟缺血再灌注后心肌內(nèi)ATP水平的影響
　　 與control組相比，I/R組內(nèi)ATP水平顯著降低（P＜0.05）。 Ator預(yù)處理組較I/R組心肌內(nèi)ATP水平顯著升高（P＜0.05），Ator升高ATP的效果被5-HD或LND所抑制。

24、r>　　 5、Ator對mPTP開放的影響
　　 再灌注20 min后，control組心肌NAD+含量高于其他組(P＜0.05)。Ator預(yù)處理組較I/R組顯著升高(P＜0.05)，提示Ator預(yù)處理通過抑制mPTP的開放而阻止NAD+降低。5-HD與LND單獨使用時均不影響心肌NAD+含量（P＞0.05），但是當(dāng)與Ator聯(lián)合應(yīng)用時，5-HD或LND均可消除Ator對mPTP開放的抑制作用。
　　 6、心肌細胞超微

25、結(jié)構(gòu)的變化
　　 與control組相比，I/R組線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大的變化:肌原纖維粗細不均，肌節(jié)結(jié)構(gòu)不清，部分肌絲破壞，溶解。線粒體明顯腫脹，內(nèi)呈空泡狀，可見嵴斷裂、稀疏，甚至消失。糖原顆粒數(shù)量明顯減少。Ator預(yù)處理明顯改善心肌細胞超微結(jié)構(gòu)變化。但是5-HD或LND取消了Ator的保護作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、阿托伐他汀可不受神經(jīng)體液因素影響，直接作用于心肌，發(fā)揮心肌保護作用。
　　 2、阿

26、托伐他汀有最佳保護用藥濃度，劑量過大，將會產(chǎn)生細胞毒性。
　　 3、阿托伐他汀的心肌保護作用是通過mitoKATP通道的活化和mPTP開放的抑制介導(dǎo)的，并且mitoKATP通道可能位于mPTP的上游。
　　 第三部分阿托伐他汀預(yù)處理對原代培養(yǎng)心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護作用及其相關(guān)機制的探討
　　 目的:
　　 研究阿托伐他汀預(yù)處理對原代乳鼠心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷是否具有保護作用及線粒體在其中的作

27、用。
　　 方法:
　　 從新生SD大鼠分離原代心肌細胞。建立體外缺血再灌注模型，心肌細胞經(jīng)歷氧糖剝奪10h，再灌注3h。
　　 新生大鼠心肌細胞隨機分為以下7組:
　　 (1) control組:細胞在正常條件下培養(yǎng)。
　　 (2) OGD/R(oxygen-glucose deprivation/reperfusion)組:細胞經(jīng)歷10 h OGD和3h再灌注。
　　 (3) Ator

28、組:分別于OGD前預(yù)處理Ator1 h，3h，6h，12h或24 h，確定Ator最佳保護用藥時間;OGD前分別預(yù)處理Ator（0.01μM，0.1μM，1μM，10μM）3h（Ator最佳用藥時間為3h），確定Ator最佳保護用藥濃度。
　　 (4) Ator+5-HD組:細胞首先預(yù)處理5-HD（100μM）20 min，然后OGD前預(yù)處理Ator（1μM）3h。
　　 (5) Ator+LND組:OGD前預(yù)處理Ato

29、r（1μM）3h，在再灌注開始時給予LND(30μM)20min。
　　 (6) 5-HD組:細胞首先預(yù)處理5-HD(100μM)20 min，然后OGD前與普通培養(yǎng)基孵育3h。
　　 (7) LND組:在再灌注開始時給予LND(30μM)20 min。
　　 再灌注3h后，測定MTT和乳酸脫氫酶(LDH)判斷細胞損傷程度。再灌注20 min后，用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測定mPTP的開放情況，鈣濃度，線粒體膜電

30、位。用流式細胞技術(shù)及激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)測定活性氧(ROS)。
　　 結(jié)果:
　　 1、Ator預(yù)處理對心肌細胞活力的影響
　　 與OGD/R組相比，5個不同時間段的Ator預(yù)處理均有顯著性差異(P＜0.05)。其中Ator預(yù)處理3h的心肌保護作用最佳。將此作用時間應(yīng)用于以下實驗方案。
　　 與OGD/R組相比，四種不同濃度的Ator預(yù)處理均有顯著性差異(P＜0.05)。其中，1μM的Ator預(yù)處理心

31、肌保護作用最佳。mitoKATP通道的阻斷劑5-HD或mPTP的開放劑LND的聯(lián)合應(yīng)用取消了Ator增加心肌細胞活力的作用（P＜0.05）。與OGD/R組比較，單獨給予5-HD或LND對心肌細胞活力無明顯影響（P＞0.05）。
　　 2、Ator對心肌細胞LDH的影響
　　 與control組相比，OGD/R組心肌細胞上清液中LDH水平明顯上升(P＜0.05)。Ator預(yù)處理組LDH水平較OGD/R組顯著降低(P＜0.0

32、5)。5-HD或LND與Ator聯(lián)合應(yīng)用時，均阻斷了Ator降低LDH的作用。
　　 3、Ator預(yù)處理對mPTP開放程度的影響
　　 OGD/R組心肌細胞熒光強度較弱，明顯低于control組(P＜0.05)。Ator預(yù)處理組熒光強度明顯高于OGD/R組（P＜0.05），表明Ator抑制mPTP的開放。5-HD或LND取消了Ator預(yù)處理對mPTP開放的抑制作用。5-HD組和LND組的熒光相對值與OGD/R組比較無顯著

33、性差異。
　　 4、Ator預(yù)處理對ROS的影響
　　 OGD/R組與control組相比，心肌細胞內(nèi)ROS水平明顯升高(P＜0.05)，Ator預(yù)處理組心肌細胞ROS水平較OGD/R組下降(P＜0.05)。加入5-HD或LND聯(lián)合Ator治療后，心肌細胞內(nèi)的ROS水平增加，說明5-HD或LND阻斷了Ator降低ROS的效果。
　　 5、Ator預(yù)處理對鈣濃度的影響
　　 OGD/R組熒光強度較contr

34、ol組明顯增強（P＜0.05）。Ator預(yù)處理組可見熒光強度較OGD/R組明顯減弱，表明Ator預(yù)處理對OGD/R所致的鈣超載有抑制作用，鈣超載減輕。此效果可被5-HD或LND所阻斷(P＜0.05)。
　　 6、Ator預(yù)處理對線粒體膜電位的影響
　　 OGD/R組明顯的減少了TMRE熒光強度，表明了線粒體膜電位的下降。OGD前給予Ator預(yù)處理，明顯的抑制了OGD/R所致的TMRE熒光的降低，減少了線粒體膜電位的下降。