柳穿魚黃素對人鼻咽癌C666-1細(xì)胞抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國南方高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首;在流行病學(xué)、遺傳學(xué)和地理分布上都有其顯著的特征。盡管放射治療對早期鼻咽癌可以達(dá)到較高的治愈率，但是對于晚期鼻咽癌，放射治療卻很難達(dá)到令人滿意的治療效果。鼻咽癌局部復(fù)發(fā)和頻發(fā)的癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌患者經(jīng)過放射治療后失敗的兩大主要原因[1]。因此需要探索新的治療手段來降低鼻咽癌的發(fā)病率和病情的嚴(yán)

2、重程度。
　　柳穿魚黃素是藥用植物大薊科飛機(jī)草中的一種活性成分。飛機(jī)草這種植物在臨床治療中通常是用于制作止血類藥物。研究表明柳穿魚黃素發(fā)揮了有效的細(xì)胞毒活性[2，3]。因此，柳穿魚黃素顯示了治愈細(xì)胞增殖異常類疾病的可能性，比如癌癥;而且吸引了研究者考慮將其作為化療藥物的備選。柳穿魚黃素已經(jīng)表現(xiàn)出具有使細(xì)胞凋亡的活性，但是具體的凋亡機(jī)制尚未研究明了。柳穿魚黃素抗鼻咽癌作用未見報(bào)道，本課題組擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)，了解柳穿魚黃素對鼻

3、咽癌C666-1細(xì)胞的體內(nèi)外抗腫瘤作用，并進(jìn)一步了解其抗癌作用機(jī)制，為深層次使用柳穿魚黃素抗鼻咽癌打下基礎(chǔ)。
　　第一部分 柳穿魚黃素體外抗鼻咽癌C666-1細(xì)胞作用研究
　　方法:
　　通過采用CCK-8法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測，了解柳穿魚黃素對鼻咽癌C666-1細(xì)胞增殖以及凋亡的影響，尋找其抗鼻咽癌作用機(jī)制;并通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及劃痕遷移實(shí)驗(yàn)了解柳穿魚黃素對鼻咽癌C66

4、6-1細(xì)胞遷移的影響。
　　結(jié)果:
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在C666-1細(xì)胞中加入柳穿魚黃素，濃度范圍從2至512微克/毫升，處理時(shí)間為24小時(shí)。與對照組DMSO比較，柳穿魚黃素處理組表現(xiàn)為劑量依賴性抗增殖活性。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果，C666-1細(xì)胞在濃度40微克/毫升的柳穿魚黃素處理組的克隆數(shù)相對比于DMSO處理組降低近66.4％(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較柳穿魚黃素具有

5、促進(jìn)C666-1細(xì)胞凋亡的作用;與對照組比較C666-1細(xì)胞經(jīng)過柳穿魚黃素處理后線粒體膜電位呈塌陷狀態(tài)，24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加。
　　Western blot檢測結(jié)果表明，與對照組比較，柳穿魚黃素處理組細(xì)胞內(nèi)CleavedCaspase-3、9蛋白表達(dá)升高。
　　Transwell實(shí)驗(yàn)中遷移細(xì)胞數(shù)在柳穿魚黃素處理組低于在DMSO對照組中的細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;劃痕實(shí)驗(yàn)中，在柳穿魚黃素處理組的細(xì)胞相

6、對遷移距離小于DMSO對照組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　柳穿魚黃素具有抑制人鼻咽癌C666-1細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，可能與其升高細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase-3、9蛋白表達(dá)及ROS水平，觸發(fā)線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　第二部分 柳穿魚黃素對C666-1細(xì)胞裸鼠移植瘤的作用
　　方法:
　　建立人鼻咽癌C666-1裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分為對照組、柳穿魚黃素高

7、、中、低劑量組（80、40、20mg/kg/d組）、順鉑組(DDP)，分別腹腔注射給藥。4周后處死裸鼠，比較各組的抑瘤作用;對裸鼠移植瘤標(biāo)本進(jìn)行光鏡、原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)、免疫組織化學(xué)方法檢測標(biāo)本中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-XL和active Caspase-3的表達(dá)變化;并通過實(shí)驗(yàn)了解柳穿魚黃素對裸鼠的毒性影響。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各實(shí)驗(yàn)組裸

8、鼠移植瘤體積及質(zhì)量均小于對照組(P＜0.01);各實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中Bax、active Caspase-3蛋白的表達(dá)高于對照組(P＜0.01)，Bcl-XL蛋白的表達(dá)低于對照組(P＜0.05);TUNEL結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織細(xì)胞凋亡指數(shù)高于對照組(P＜0.01)。高劑量柳穿魚黃素對裸鼠外周血常規(guī)無明顯抑制作用(P＞0.05)，病理組織學(xué)檢查顯示對心臟、肝臟和腎臟無明顯毒性。
　　結(jié)論:
　　柳穿魚黃素可抑制人鼻咽癌C