大電導(dǎo)鉀離子通道C端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)純化.pdf

1、本論文主要進(jìn)行了大電導(dǎo)鉀離子通道家族(SLO家族)和與PDZ結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的激酶(PBK)兩方面的工作。鉀離子通道是一種陽(yáng)離子通道，它與細(xì)胞靜息電位的形成具有密切的關(guān)系。在神經(jīng)組織和興奮組織中，它決定著興奮電位的持續(xù)時(shí)間和興奮頻率。通常的鉀離子通道只受電壓調(diào)控，而SLO家族不僅受電壓調(diào)控，還被其他因素如鈣離子，鈉離子，氯離子，pH值和磷酸化所調(diào)節(jié)。另外此家族的單一通道的通透性(即衡量在一定的膜電位下通過(guò)開放的通道流入的電荷的數(shù)量)也非常大

2、，這些特性使得SLO家族在功能上區(qū)別于一般的鉀離子通道。普遍認(rèn)為，SLO通道C末端的兩個(gè)RCK(調(diào)控鉀離子通道電導(dǎo))結(jié)構(gòu)域賦予了SLO家族這些獨(dú)特的性質(zhì)。因此其三維結(jié)構(gòu)的解析和研究，對(duì)于闡明其機(jī)理至關(guān)重要。
　　 首先嘗試表達(dá)人源SLO家族四個(gè)成員的C末端結(jié)構(gòu)域，但是卻沒(méi)有得到可溶性的目的蛋白。隨后嘗試表達(dá)低等種屬果蠅SLO家族成員dSLO1的C末端的結(jié)構(gòu)域，通過(guò)篩選多種表達(dá)條件，最終獲得了可溶性表達(dá)。但是該融合蛋白N端的MBP

3、標(biāo)簽不能被PreScission(蛋白酶)切割。通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將dSLO1 C末端的一段無(wú)規(guī)則卷曲去掉后得到dSLO1t基因，其在同樣的表達(dá)條件下獲得了較大量的可溶表達(dá)，且其標(biāo)簽可以被PreScission剪切。經(jīng)過(guò)一系列的純化后，得到純度較高的dSLO1t目的蛋白，但是從純化結(jié)果推測(cè)，dSLO1t目的蛋白是高度聚合的，因此并不適合結(jié)晶條件的篩選。
　　 PBK蛋白的表達(dá)、純化和結(jié)晶嘗試是本論文的第二部分工作。PBK蛋白具有

4、調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程的作用，它與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，是治療癌癥的靶目標(biāo)。因此解析PBK的三維結(jié)構(gòu)、找出PBK行使作用的關(guān)鍵位點(diǎn)就顯得非常地重要。
　　 為了解析有活性的PBK的三維結(jié)構(gòu)，用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了大量的有活性的野生型PBK和將第9位的蘇氨酸突變?yōu)楣劝彼岬腜BKT9E。經(jīng)過(guò)鎳親和層析柱、Superdex200的純化后得到了高純度、高濃度的PBK和PBKT9E。但是由于天然和突變體均存在狀態(tài)不均一的現(xiàn)象，導(dǎo)致不能得到晶體。本部分工作