模擬微重力效應(yīng)對(duì)海藻酸鈉三維培養(yǎng)心肌細(xì)胞的影響.pdf

1、微重力可致航天員在太空飛行過程中生理機(jī)能發(fā)生改變。這些變化主要包括心血管系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的病理性改變,其中心血管系統(tǒng)病理性改變是造成空間飛行過程中航天員不能順利完成空間作業(yè),甚至猝死的主要原因。因此,探討微重力對(duì)心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響及其相關(guān)機(jī)制,可為進(jìn)一步建立基于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)的有效防護(hù)措施提供理論基礎(chǔ),對(duì)于保證航天員在太空飛行時(shí)的健康和有效工作具有重要意義。
　　由于在空間進(jìn)行微重力實(shí)驗(yàn)耗資大,機(jī)會(huì)有限,因此地面

2、模擬微重力效應(yīng)是目前空間生物學(xué)與航天醫(yī)學(xué)研究的主要研究方式。為了克服模擬微重力效應(yīng)研究中細(xì)胞二維培養(yǎng)的不足,本研究構(gòu)建了一種新型的海藻酸鈉微囊體,使細(xì)胞在該載體內(nèi)呈三維生長,以保證盡可能實(shí)現(xiàn)在體細(xì)胞的特征。為了選擇力學(xué)性能穩(wěn)定,可以對(duì)抗回轉(zhuǎn)過程產(chǎn)生的剪切力作用的載體材料,本實(shí)驗(yàn)首先利用流變儀檢測了不同組成成分的海藻酸鈉微囊體力學(xué)性能,結(jié)果顯示1:30:0.05海藻酸鈉/膠原/殼聚糖為最佳組成。掃描電鏡顯示微囊體為內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu),有利于細(xì)胞

3、培養(yǎng)。其次,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明心肌細(xì)胞在該微囊體內(nèi)的穩(wěn)定增殖,原代心肌細(xì)胞在微囊體內(nèi)可形成類心肌組織,并維持長期搏動(dòng)。因此,海藻酸鈉/膠原/殼聚糖微囊體包覆心肌細(xì)胞可用于后續(xù)微重力效應(yīng)的相關(guān)研究。
　　為了進(jìn)一步研究海藻酸鈉微囊體用于模擬微重力效應(yīng)研究的可靠性,本研究利用回轉(zhuǎn)儀以轉(zhuǎn)數(shù)15rpm回轉(zhuǎn)培養(yǎng)24hr,比較海藻酸鈉微囊體和cytodex微球?yàn)檩d體的心肌細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)改變,發(fā)現(xiàn)兩者微絲結(jié)構(gòu)變化相似,此外不同表型的乳腺癌細(xì)胞在海藻

4、酸鈉微囊體中回轉(zhuǎn)培養(yǎng)48hr后,乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變,表明海藻酸鈉微囊體用于模擬微重力效應(yīng)研究的可行性。
　　在構(gòu)建以海藻酸鈉微囊體為載體的細(xì)胞三維培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上,本文利用免疫熒光染色、MTT和流式細(xì)胞儀等方法研究了模擬微重力效應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、增殖和凋亡的影響,結(jié)果表明模擬微重力效應(yīng)24hr導(dǎo)致三維培養(yǎng)的心肌細(xì)胞偽足消失,增殖能力降低,36hr出現(xiàn)早期凋亡,并在回轉(zhuǎn)培養(yǎng)72hr時(shí)出現(xiàn)DNA損傷。
　　為了深入研究

5、模擬微重力效應(yīng)對(duì)三維培養(yǎng)的心肌細(xì)胞功能的影響及其相應(yīng)機(jī)制,本研究還分析了心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率的變化,通過顯微鏡觀察海藻酸鈉微囊體內(nèi)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率,發(fā)現(xiàn)模擬微重力效應(yīng)24hr可致原代心肌細(xì)胞收縮頻率改變,表明模擬微重力效應(yīng)改變?nèi)S培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的搏動(dòng)功能。同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot分析了模擬微重力效應(yīng)與介導(dǎo)興奮-收縮耦聯(lián)的縫隙連接蛋白Connexin43以及影響心肌功能的離子通道蛋白(鈉離子通道蛋白、L-鈣離子通道蛋

6、白、鈉鉀泵、鈉氫交換體)表達(dá)變化的關(guān)系,研究結(jié)果提示模擬微重力效應(yīng)對(duì)編碼鈉通道的基因SCN5a表達(dá)未造成明顯影響,而其余通道蛋白均有不同程度的表達(dá)變化(Connexin43表達(dá)呈一過性改變,可產(chǎn)生適應(yīng)性恢復(fù);L-鈣通道蛋白表達(dá)增高;鈉鉀泵和鈉氫交換體表達(dá)降低),說明模擬微重力效應(yīng)改變了動(dòng)作電位產(chǎn)生的分子基礎(chǔ),從而導(dǎo)致心肌搏動(dòng)功能改變。此外,尾懸吊大鼠實(shí)驗(yàn)也表明模擬微重力效應(yīng)改變了心肌離子通道蛋白表達(dá),其中Connexin43和鈉氫交換體

7、改變與體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞改變一致,而L-鈣通道蛋白和鈉鉀泵表達(dá)與體實(shí)驗(yàn)相反,以上研究結(jié)果提示神經(jīng)體液調(diào)控參與了模擬微重力效應(yīng)下心肌組織離子通道蛋白的表達(dá)。
　　在以上研究的基礎(chǔ)上,為了深入分析模擬微重力效應(yīng)下線粒體氧化應(yīng)激響應(yīng)的協(xié)同變化,利用線粒體特異探針熒光染色、活性氧探針DCFH-DA、Rh123染色以及抗氧化酶活性檢測試劑盒研究了心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生及相關(guān)機(jī)制,結(jié)果表明模擬微重力效應(yīng)24hr心肌線粒體分布發(fā)生改變,48hr

8、細(xì)胞活性氧顯著增加,線粒體膜電位改變,導(dǎo)致心肌處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。同時(shí)心肌細(xì)胞抗氧化物酶活性增強(qiáng)、熱休克蛋白和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB高表達(dá)。抗氧化物SOD活性分析表明回轉(zhuǎn)培養(yǎng)的氧化應(yīng)激機(jī)制可能以超氧化物為主。此外,線粒體的氧化應(yīng)激研究結(jié)果也提示氧化應(yīng)激參與了心肌細(xì)胞模擬微重力效應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制,而且與心肌細(xì)胞搏動(dòng)變化及部分離子通道的變化具有一致性。
　　綜上,本研究通過構(gòu)造新型海藻酸鈉微囊體,建立了適用于模擬微重力效應(yīng)研究的細(xì)胞三維培養(yǎng)體系