基于mTOR靶標(biāo)小豆蔻明調(diào)節(jié)糖代謝的研究.pdf

1、目的
　　 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）為胰島素信號(hào)通路中的重要調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖和生長(zhǎng)。在胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）狀態(tài)下，過度活化的mTOR及其下游底物核糖體蛋白S6激酶1（ribosomAlS6 kinase 1，S6K1）可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)阻斷胰島素信號(hào)通路，導(dǎo)致糖代謝紊亂。小豆蔻明（Cardamonin，CAR）

2、能通過抑制mTOR活性逆轉(zhuǎn)高果糖誘導(dǎo)的IR大鼠血管增生性病變，同時(shí)改善整體動(dòng)物IR狀態(tài)，降低空腹血清胰島素含量，增強(qiáng)胰島素敏感指數(shù)。本研究重點(diǎn)考察CAR對(duì)糖代謝過程中關(guān)鍵酶以及胰島素信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子的影響，深入探討CAR影響糖代謝的作用機(jī)制。
　　 方法
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 采用組織貼塊方法原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells,vsMCs）。高糖高胰島素（2.

3、5×10-2 mol·L-1葡萄糖和100U·L-1胰島素）培養(yǎng)基誘導(dǎo)胰島素抵抗。
　　 2分組與給藥
　　 正常培養(yǎng)細(xì)胞設(shè)立正常對(duì)照組、0.1％ 二甲亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶劑對(duì)照組，高糖高胰島素誘導(dǎo)IR培養(yǎng)后，分別設(shè)立模型對(duì)照組、模型溶劑對(duì)照組（0.1％ DMSO），吡格列酮組（10-5 mol·L-1），RAP組（10-7 mol·L-1）及CAR組（10-6、10-5 mol·L-

4、1）；
　　 細(xì)胞以PA干預(yù)后，設(shè)正常對(duì)照組，溶劑對(duì)照組（0.1％ DMSO），RAP組（10-7 mol·L-1）及CAR組（10-6、10-5 mol·L-1）。
　　 3 測(cè)定指標(biāo)及方法
　　 3.1己糖激酶法測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖含量
　　 3.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖
　　 3.3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯(lián)比色法測(cè)定己糖激酶活性
　　 3.4 硫酸蒽酮法測(cè)定細(xì)胞中糖原含量
　

5、　 3.5 Western Blot法檢測(cè)糖代謝相關(guān)信號(hào)分子葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glucose transporter 4，Glut4）、糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、己糖激酶（Hexokinase，HK）和胰島素信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子胰島素受體底物1（insulin receptor substrate，IRS-1）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、mTO

6、R、S6K1總蛋白蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)
　　 結(jié)果
　　 1高糖高胰島素培養(yǎng)VSMCs 72 h可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，IR細(xì)胞平均葡萄糖消耗量、己糖激酶活性以及糖原含量顯著性降低（P<0.01）；
　　 2 CAR（10-5、10-6 mol·L-1）能增加胰島素抵抗VSMCs平均葡萄糖消耗量，增強(qiáng)己糖激酶活性以及細(xì)胞內(nèi)糖原合成（P<0.01），其中10-5 mol·L-1作用較強(qiáng)；
　　 3 CA

7、R能增加IR血管平滑肌細(xì)胞HK蛋白表達(dá)（P<0.01），抑制GSK-3β的表達(dá)，增強(qiáng)其磷酸化（P<0.01），但對(duì)Glut4的表達(dá)無明顯影響；
　　 4 CAR激活胰島素信號(hào)通路，增強(qiáng)IR血管平滑肌細(xì)胞IRS-1的蛋白表達(dá)及活化（P<0.01）；同時(shí)增強(qiáng)Akt的磷酸化（P<0.01），而對(duì)其總蛋白的表達(dá)無顯著性影響；
　　 5 CAR抑制mTOR和S6K1活化，顯著性降低p-mTOR、p-S6K1的蛋白表達(dá)（P<0.01