玉郎傘黃酮和柿子葉黃酮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的發(fā)生和發(fā)展過程是一個多因素相互作用的級聯(lián)反應，主要的損傷機制有自由基損傷、鈣超載、微血管損傷和白細胞的作用等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，補體、選擇素、內皮素和細胞凋亡等均參與了MIRI的病理變化過程。可見，MIRI可能是多分子、多機制、相互影響、相互促進的病理變化。至今MIRI一直是心肌缺血治療中難以解決的問題。
　　 我國中藥資

2、源豐富，從中尋找防治MIRI的安全有效藥物，特別是對其活性成分進行藥效學及作用機制的研究，對于開發(fā)我國豐富的中藥資源和促進中藥現(xiàn)代化具有重要意義。
　　 多年來，本課題組一直致力于發(fā)掘廣西豐富的民族草藥資源，篩查副作用小、療效較好的廣西民族草藥/活性部位。我們前期開展了大量的基礎研究工作，階段性實驗發(fā)現(xiàn)：(1)從玉郎傘分離得到的玉郎傘黃酮(YLSF)預處理能明顯降低MIRI大鼠血漿中AST、LDH、LDH1和MDA含量，能提高S

3、OD活性，降低心肌梗死范圍。提示，YLSF對大鼠心肌MIRI具有顯著的保護作用。此外，兩種YLS單體對體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷具有保護作用，其機制可能與清除自由基、抑制心肌細胞Ca2+超載有關；進一步研究還發(fā)現(xiàn)，YLS兩種黃酮單體尚具有抗氧化、耐缺氧、抗凝血以及有較強的清除自由基的作用。(2)從柿葉提取得到的PLF可顯著改善MIRI所致的大鼠離休心功能損傷，減少CK、CK-MB、LDH、LDH1的釋放和心肌組織MDA的產生

4、，增加SOD、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性，說明，PLF對大鼠MIRI具有保護作用，其機制可能與提高SOD活性、抗氧自由基、減少脂質過氧化反應有關。而研究PLF對血壓的影響，發(fā)現(xiàn)PLF對正常大鼠和L-NAME誘導的高血壓大鼠的血壓和心率均有降低作用。另一研究證明，PLF可能是通過增加內源性舒血管活性物質的釋放和減少內源性收縮血管活性物質的釋放來調節(jié)兩者之間的平衡而發(fā)揮其抗高血壓作用。
　　 總之，前期研究表明

5、，YLSF和PLF對大鼠MIRI具有明顯的保護作用，其作用機制與抗氧化、清除氧自由基等多個環(huán)節(jié)有關。為了更進一步地了解YLSF和PLF對大動物(猴、犬)MIRI的影響，完善其臨床前研究，我們分別用猴和犬MIRI模型，研究YLSF和PLF對MIRI的保護作用，研究分兩部分：
　　 第一部分：玉郎傘黃酮對猴心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究目的：研究玉郎傘黃酮(YLSF)對猴心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護作用及其機制。

6、r>　　 方法：將實驗猴隨機分為5組，每組4只：假手術(SHAM)組、心肌缺血再灌注損傷(MIRI)模型組、YLS黃酮低劑量組(YLSFL)組、YLS黃酮高劑量(YLSFH)組、地爾硫卓陽性藥(DIL)組。缺血前30min經十二指腸注射給藥。結扎冠狀動脈左前降支60min后，再灌注180min，建立MIRI模型。再灌注結束后測定下列各項指標：(1)利用MPA心功能分析系統(tǒng)觀察并紀錄在急性缺血和再灌注狀態(tài)下血流動力學指標(HR、LVSP

7、、Lvedp、+dp/dtmax、-dp/dtmax)的變化。(2)取缺血區(qū)的心肌組織，常規(guī)制作組織切片、電鏡切片，光鏡、電鏡下觀察心肌組織病理結構和超微結構的變化并拍照。(3)從股靜脈脈采血，離心，取上層血清，測定AST、LDH、LDH1、CK、CK-MB、SOD、GSH-Px、TNOS、MDA和NEFA；取缺血區(qū)心肌組織，按試劑盒說明測定Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性。(4)取缺血區(qū)心肌組織，測定心肌組

8、織凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達、核因子-κB表達、心肌細胞凋亡、心肌ANT1、Caspase-3mRNA表達。
　　 結果：(1)YLSF對心臟血流動力學的影響：與模型組比較，YLSFH、YLSFL組在再灌注180min時對LVSP、+dp/dtmax有明顯的提高作用，而對HR、LVDEP和-dp/dtmax的作用不明顯。(2)YLSF對血液生化學指標的影響：YLSF能明顯下調各心肌酶、MDA和NEFA含量；提高SOD、G

9、SH-Px、Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase活性。(3)YLSF對心肌組織形態(tài)學的影響：從組織病理學角度上看，與模型組比較，YLSF給藥組心肌受損程度明顯減輕。(4)YLSF對相關蛋白Bcl-2和Bax表達、核因子-κB表達的影響：YLSFH、YLSFL組均能明顯降低心肌Bax蛋白表達，能顯著增加Bcl-2/Bax的比率。YLSFH能明顯增加Bcl-2蛋白表達，而YLSFL則對Bcl-2蛋白表達無影響。YLSF給

10、藥組NF-κBp65表達降低，陽性細胞百分率下降。(5)YLSF對心肌細胞凋亡的影響：YLSFH組可減輕心肌細胞凋亡程度。(6)YLSF對心肌ANT1、Caspase-3mRNA表達的影響：與MIRI組比較，YLSFH組、YLSFL組ANT1mRNA表達上調(P＜0.05)，YLSH組Caspase3的mRNA表達下調(P＜0.05)。(7)YLSF對心肌細胞超微結構的影響：YLSF能明顯減輕心肌超微結構的破壞。
　　 結論：Y

11、LSF對猴MIRI具有顯著的保護作用，其機制可能與改善心功能、抗脂質過氧化損傷、下調Bax蛋白表達、增加Bcl-2/Bax的比率，下調NF-κBp65表達，減輕心肌細胞凋亡程度，以及上調ANT1mRNA的表達以及通過下調Caspase3mRNA的表達有關。
　　 第二部分：柿葉黃酮對犬心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究
　　 目的：研究柿葉黃酮(PLF)對犬心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護作用并對其機制進行初步探

12、討。
　　 方法：選取實驗用比格犬隨機分為5組，每組6只：假手術組、心肌缺血再灌注損傷(MIRI)組、柿葉黃酮低劑量(PLFL)組、柿葉黃酮高劑量(PLFH)組、地爾硫卓(DIL)組。缺血前30min經十二指腸注射給藥。結扎冠狀動脈左前降支60min后，再灌注180min，建立MIRI模型。再灌注結束后測定下列各項指標：(1)利用MPA心功能分析系統(tǒng)觀察并紀錄在急性缺血和再灌注狀態(tài)下血流動力學指標(HR、LVSP、Lvedp、+

13、dp/dtmax、-dp/dtmax、IT、ET、IT/ET)的變化。(2)取缺血區(qū)的心肌組織，常規(guī)制作組織切片、電鏡切片，光鏡、電鏡下觀察心肌組織病理結構和超微結構的變化并拍照。(3)從股靜脈脈采血，離心，取上層血清，按試劑盒說明測定AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1，SOD、GSH-Px和TNOS的活性、MDA和NEFA含量；取缺血區(qū)心肌組織，按試劑盒說明測定AST、CK、CK-MB、LDH、LDH1，SOD、GSH-Px、

14、TNOS、ATP酶的活性、MDA和NEFA含量。(4)取缺血區(qū)心肌組織，免疫組化法測定Bcl-2和Bax蛋白表達。
　　 結果：(1)與MIRI組相比，在再灌注180min(r180min)時，PLFH組HR、LVSP、+dp/dtmax、ET顯著高于MIRI組(P＜0.01或P＜0.05)，而Lvedp、-dp/dtmax、IT、IT/ET顯著低于MIRI組(P＜0.01或P＜0.05)。(2)光鏡下觀察，MIRI組心肌纖維排

15、列紊亂、腫脹、部分斷裂，甚至出現(xiàn)片狀壞死，周圍有炎性細胞浸潤，紅細胞漏出明顯。PLFL、PLFH組的損傷明顯減輕。電鏡下觀察，MIRI組的心肌細胞的肌絲、線粒體、閏盤等破壞明顯，而PLFL、PLFH組則明顯減輕。(3)與MIRI組比較，PLF能顯著抑制血清中心肌酶活性和MDA、NEFA含量的提高，抑制血清中SOD、GSH-Px、TNOS活性的降低(P＜0.01或P＜0.05)；PLF還能同時降低組織中MDA和NEFA含量，提高心肌酶、S

16、OD、GSH-Px和ATP酶的活性(P＜0.01或P＜0.05)。(4)與MIRI組比較，PLFL、PLFH組Bcl-2蛋白表達明顯增高(P＜0.01或P＜0.05)，而NF-κBp65、Bax蛋白表達及Bax/Bcl-2的比值明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 結論：柿PLF對MIRI具有明顯的保護作用。其抑制可能與抗脂質過氧化損傷、保護ATP酶活性、降低NEFA含量、提高TNOS活性、改善心功能和抑制心肌細胞凋亡