金納米星SERS探針的構(gòu)筑及其在細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、拉曼光譜是一種無(wú)損光譜技術(shù)，具有指紋識(shí)別的特征，能在分子水平獲得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)主要是納米尺度的粗糙表面所具有的異常光學(xué)增強(qiáng)現(xiàn)象，它可以將吸附在材料表面分子的拉曼信號(hào)放大102～106倍，與常規(guī)拉曼散射相比具有更高的檢測(cè)靈敏度。SERS還具有穩(wěn)定、不易猝滅、不受生物樣品自身熒光及水的干擾等特點(diǎn)，非常適于生物樣品的檢測(cè)。金納米星是一種由金屬核和多個(gè)枝角構(gòu)成的新型納米材料，不僅在近紅外區(qū)具有可調(diào)制的局域電磁場(chǎng)，而

2、且尖銳枝角的“熱點(diǎn)”(Hot Spots)極大地增強(qiáng)了周圍電磁場(chǎng)的強(qiáng)度。本文基于金納米星構(gòu)筑了標(biāo)記SERS探針(SERS tags)和無(wú)標(biāo)記SERS探針(label-free SERS probes)，開(kāi)展了細(xì)胞的SERS檢測(cè)研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法制備金納米星，通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中氯金酸、對(duì)苯二酚以及金種子的比例，調(diào)控金納米星的枝角長(zhǎng)度和粒徑。利用掃描電子顯微鏡(SEM)、紫外-可見(jiàn)-近紅外(UV-vi

3、s-NIR)分光光度計(jì)和共聚焦拉曼光譜儀對(duì)金納米星的形貌、光學(xué)性質(zhì)和SERS效應(yīng)進(jìn)行了表征，優(yōu)化反應(yīng)條件，制得了形貌均一、單分散性好和SERS效應(yīng)強(qiáng)的金納米星。⑵以尼羅蘭(NBA)和牛血清白蛋白(BSA)分別作為拉曼信號(hào)分子和保護(hù)層，制備了一種用于細(xì)胞成像的標(biāo)記SERS探針。聚集實(shí)驗(yàn)和CCK-8細(xì)胞毒性分析驗(yàn)證了標(biāo)記SERS探針具有很好穩(wěn)定性及生物相容性。將標(biāo)記SERS探針用于人肺腺癌細(xì)胞(A549)和人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(ATⅡ)的成像

4、。結(jié)果表明標(biāo)記SERS探針主要分布在細(xì)胞質(zhì)，少量進(jìn)入細(xì)胞核，負(fù)載標(biāo)記SERS探針的細(xì)胞產(chǎn)生的拉曼信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于未負(fù)載的細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞的暗場(chǎng)成像、TEM驗(yàn)證了SERS成像的結(jié)果。⑶以對(duì)巰基苯甲酸(4-MBA)作為拉曼信號(hào)分子和表皮生長(zhǎng)因子受體抗體(anti-EGFR)與金納米星之間的偶聯(lián)劑，構(gòu)筑了一種具有細(xì)胞膜靶向功能的標(biāo)記SERS探針。將標(biāo)記SERS探針用于人正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)和人肺癌細(xì)胞(A549、H1229)的成像研究

5、。A549細(xì)胞和H1229細(xì)胞產(chǎn)生SERS信號(hào)的強(qiáng)度明顯強(qiáng)于BEAS-2B細(xì)胞，靶向到肺癌細(xì)胞上的SERS探針數(shù)量明顯多于正常細(xì)胞。暗場(chǎng)成像與X射線能譜(EDS)分析驗(yàn)證了anti-EGFR偶聯(lián)金納米星成功富集到肺癌細(xì)胞表面。⑷將細(xì)胞膜穿透肽(TAT)連接到金納米星表面，構(gòu)筑了一種無(wú)標(biāo)記SERS探針用于區(qū)分肺干細(xì)胞(LR-MSCs)的分化。評(píng)價(jià)了無(wú)標(biāo)記SERS探針的穩(wěn)定性、生物相容性及探針與細(xì)胞的相互作用。測(cè)得了LR-MSCs定向分化為

6、肺泡上皮細(xì)胞(ATⅡ)或間質(zhì)細(xì)胞(3T3)的平均SERS光譜。主成分分析(PCA)基于細(xì)胞SERS光譜很好地識(shí)別和區(qū)分了LR-MSCs的不同分化亞型。⑸基于TAT功能化無(wú)標(biāo)記SERS探針，通過(guò)SERS表征了肺泡上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程。免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測(cè)了EMT過(guò)程中上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，驗(yàn)證了博來(lái)霉素(BLM)能夠誘導(dǎo)ATⅡ細(xì)胞轉(zhuǎn)化為3T3細(xì)胞。檢測(cè)了EMT不同階段細(xì)胞的SERS光譜，在EMT過(guò)程中，許多細(xì)胞組