ToMV引起番茄系統(tǒng)性壞死與移動(dòng)蛋白相關(guān).pdf

1、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的典型成員。ToMV為單鏈正義RNA病毒，基因組長(zhǎng)度約為6.4 kb; ToMV的寄主范圍十分廣泛，是一類世界性分布的最具有經(jīng)濟(jì)重要性的植物病毒之一。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于ToMV的研究主要集中在其功能蛋白與寄主的互作上，本研究構(gòu)建ToMV的農(nóng)桿菌侵染性克隆研究病毒引起番茄系統(tǒng)性壞死的分子機(jī)制。
　　基于周雪平等(1993)發(fā)現(xiàn)的To

2、MV-S1株系和由本實(shí)驗(yàn)室保存ToMV-N5株系在番茄(合作903)引起不同表型，而兩者的序列以及氨基酸相似性分別高達(dá)98.8％和97.2％。本研究以兩個(gè)株系的病毒粒子RNA為模板，采用RT-PCR擴(kuò)增其全長(zhǎng)的基因組，并通過(guò)分段克隆的方法將ToMV的基因組克隆到攜帶有35S啟動(dòng)子的載體pCB301中，陽(yáng)性克隆pToMV-N5和pToMV-S1分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，并浸潤(rùn)接種于本氏煙和番茄中。pToMV-S1和pToMV-N5浸

3、潤(rùn)接種的本氏煙3天后均開始出現(xiàn)頂端新生葉片萎焉癥狀，7天后整棵植株死亡。pToMV-N5農(nóng)桿菌侵染性克隆接種番茄（合作903）7天后頂端新生葉片開始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)并逐漸導(dǎo)致植株生長(zhǎng)停滯，嚴(yán)重者導(dǎo)致植株整棵系統(tǒng)死亡;而pToMV-S1接種寄主14天未見明顯癥狀，后期逐漸表現(xiàn)為輕花葉癥狀;在番茄的系統(tǒng)葉中Western blot均能檢測(cè)到病毒的存在，但是pToMV-S1的病毒積累量低于pToMV-N5的含量。在2種寄主上，ToMV農(nóng)桿菌侵染性

4、克隆引起的癥狀反應(yīng)均與與野生型病毒相一致，這表明pToMV-N5和pToMV-S1的農(nóng)桿菌侵染性克隆構(gòu)建成功。
　　在獲得2個(gè)病毒的農(nóng)桿菌侵染性克隆的基礎(chǔ)上，通過(guò)酶切連接的方法將ToMV的包含MP/CP區(qū)域進(jìn)行相互交換，獲得嵌合型病毒pToMV-N5MPCPs1以及pToMV-S1MPCPN5，接種本氏煙結(jié)果驗(yàn)證其具有侵染活性。含有ToMV-S1株系MP和CP的嵌合病毒（pToMV-N5MPCPs1）侵染性克隆浸潤(rùn)接種番茄合作90

5、314天未出現(xiàn)ToMV-N5引起的系統(tǒng)性壞死癥狀，而僅僅表現(xiàn)為輕微的花葉癥狀;pToMV-S1MPCPN5引起番茄系統(tǒng)性壞死癥狀，與ToMV-N5在番茄上產(chǎn)生的癥狀反應(yīng)相同。這表明ToMV-N5引起番茄系統(tǒng)性壞死表型可能與其MP、CP相關(guān)。
　　為了進(jìn)一步的確定ToMV-N5引起番茄系統(tǒng)性壞死的決定因子，本實(shí)驗(yàn)采用OverlappingPCR以及酶切連接的方法構(gòu)建2個(gè)株系的MP互換的嵌合病毒pToMV-N5MPs1和pToMV-S

6、1MPN5。病毒浸潤(rùn)接種結(jié)果表明，攜帶有ToMV-N5的MP的嵌合病毒pToMV-S1MPN5引起寄主植物出現(xiàn)了典型的系統(tǒng)性壞死癥狀，而攜帶有ToMV-S1株系MP的嵌合病毒pToMV-N5MPs1侵染性克隆接種番茄(合作903)14天沒有明顯表型，后期逐漸出現(xiàn)花葉癥狀。pToMV-S1MPN5與pToMV-N5的癥狀反應(yīng)相一致，而ToMV-N5的MP被S1株系的MP取代后則表現(xiàn)為輕花葉癥狀，這表達(dá)ToMV-N5引起番茄系統(tǒng)性壞死與其M

7、P相關(guān)。Northern blot分析病毒的基因組含量結(jié)果表明，pToMV-S1基因組含量低于pToMV-N5，而其MP被N5株系的代替后，pToMV-S1 MPN5含量大大提高;與病毒的Western blot分析的結(jié)果相一致，這表明ToMV-N5的移動(dòng)蛋白能夠提高病毒的含量，而且ToMV-N5引起番茄系統(tǒng)性壞死可能是由其病毒含量高所引起。通過(guò)對(duì)ToMV-N5和ToMV-S1的MP比對(duì)發(fā)現(xiàn)其氨基酸同源性高達(dá)98.8％以上，僅在92位、