血紅互氧合酶-1在肝硬化門脈高壓大鼠多臟器的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:我國(guó)是乙肝大國(guó),每年有許多患者發(fā)展成肝硬化甚至門脈高壓,而門脈高壓導(dǎo)致的各種并發(fā)癥,如肝腎綜合征、肝肺綜合征等,也會(huì)顯著增加患者的死亡率。目前對(duì)肝硬化門脈高壓及其各種并發(fā)癥的病理生理機(jī)制的認(rèn)識(shí)還未完全清楚,治療效果也不滿意。因而探討肝硬化門脈高壓及其各種并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)理,以尋求干預(yù)途徑和方法勢(shì)在必行。以往研究發(fā)現(xiàn),一氧化氮(nitric oxide,NO),作為一種血管擴(kuò)張物質(zhì),在肝硬化外周血管擴(kuò)張和高動(dòng)力循環(huán)的發(fā)生、發(fā)展中起著重

2、要的作用,在肝腎綜合征和肝肺綜合征的發(fā)病中也起著一定的作用。內(nèi)源性一氧化碳(carbon monoxide,CO)是血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的降解產(chǎn)物,作為體內(nèi)一種重要的氣體信使分子,在很多方面和NO相似,參與體內(nèi)的多種病理生理過(guò)程。我們以前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HO-CO系統(tǒng)在肝纖維化大鼠模型的肝臟中表達(dá)增加,并對(duì)肝臟起著保護(hù)性作用。目前對(duì)于HO-CO系統(tǒng)的研究主要集中在肝細(xì)胞的保護(hù)和抗炎作用,對(duì)其在肝硬化

3、門脈高壓階段所起的作用,是保護(hù)肝臟還是加重肝細(xì)胞損害,國(guó)內(nèi)外報(bào)道的文獻(xiàn)很少;在肝外組織器官的研究多集中在單一臟器,缺乏多臟器系統(tǒng)全面的研究,HO-1在肝外器官,如腎臟、肺臟中的表達(dá)是否具有組織差異性,以及HO-1在這些臟器中的作用機(jī)制如何,目前仍然不清楚;此外,針對(duì)肝硬化及并發(fā)癥的相應(yīng)干預(yù)治療的研究較少,而且缺乏在疾病不同階段對(duì)該系統(tǒng)變化及作用的認(rèn)識(shí)。本研究的目的就是探討在肝硬化門脈高壓階段,HO-1在肝臟、腎臟、肺臟中的表達(dá)與這些臟器

4、結(jié)構(gòu)、功能改變之間的關(guān)系,通過(guò)給予HO-1的誘導(dǎo)劑和抑制劑來(lái)調(diào)控HO-1的活性,揭示其在各臟器中的作用,為尋找治療肝硬化及門脈高壓并發(fā)癥的方法提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研究共分三部分。
　　 第一部分 HO-1在肝硬化門脈高壓大鼠肝臟中的表達(dá)及意義
　　 第二部分 HO-1在肝腎綜合征大鼠模型腎臟中的表達(dá)及對(duì)腎臟病理和腎功能的影響
　　 第三部分 HO-1在肝肺綜合征大鼠模型肺臟中的表達(dá)及對(duì)肺血管和肺功能的

5、影響
　　 方法:取健康雄性SD大鼠44只,隨機(jī)分成4組:假手術(shù)(SH)組8只、肝硬化門脈高壓(PH)組12只、鋅原卟啉(ZnPP)組12只、鈷原卟啉(CoPP)組12只。PH組應(yīng)用膽總管結(jié)扎的方法制備肝硬化門脈高壓大鼠模型,4周后模型形成取材。ZnPP組和CoPP組制模方法同PH組,取材24小時(shí)前分別給予ZnPP或CoPP腹腔注射一次,PH組給予等量的生理鹽水腹腔注射。所有大鼠最后24小時(shí)在生物籠中收集尿量,檢測(cè)尿肌酐、尿鈉;

6、生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)儀測(cè)定大鼠的門靜脈壓力、平均動(dòng)脈壓,超聲測(cè)量腎動(dòng)脈血流量,檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)?之后將大鼠處死,采集靜脈血;取肝、腎和肺組織。通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法觀察大鼠肝臟、腎臟和肺臟HO-1蛋白的表達(dá):Western-blot方法測(cè)定上述臟器HO-1蛋白的表達(dá);RT-PCR的方法檢測(cè)大鼠上述臟器HO-1 mRNA的水平。HE染色觀察肝臟、腎臟、肺臟的結(jié)構(gòu)改變;血?dú)夥治鰴z測(cè)動(dòng)脈血中碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin,COHb)的濃

7、度及肺泡—?jiǎng)用}氧分壓差(A-aPO2);采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase,AST)反映肝臟功能;肌酐清除率、血鈉和尿鈉濃度反映腎功能;A-aPO2反映肺功能變化。
　　 結(jié)果:1、肝硬化門脈高壓大鼠模型復(fù)制成功
　　 (1)PH組大鼠毛色蓬亂而不光滑,精神萎靡,食欲不振,活動(dòng)減

8、少,尿色黃,便色淺,腹部膨隆;解剖腹腔內(nèi)見大量腹水;
　　 (2)血清生化指標(biāo)AST測(cè)定結(jié)果顯示:與SH組相比,PH組明顯升高(209.11±45.77 U/L vs156.8±18.28 IU/L,P＜0.05);
　　 (3)與SH組相比,PH組的門靜脈壓力顯著升高(15.56±2.36 mmHg vs9.24±0.76 mmHg,P＜0.01);
　　 (4)與SH組相比,PH組的平均動(dòng)脈壓力顯著降低(59

9、.23±12.19 mmHg vs118.83±8.09 mmHg,P＜0.01);
　　 (5)HE染色結(jié)果顯示PH組大鼠肝臟細(xì)胞橋樣壞死,肝細(xì)胞結(jié)節(jié)樣再生,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、破壞,匯管區(qū)見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),假小葉形成。
　　 2、HO-1在肝硬化門脈高壓大鼠肝臟中的表達(dá)及意義
　　 (1)與SH組相比,免疫組織化學(xué)方法、Western-blot方法及RT-PCR方法顯示PH組肝臟HO-1表達(dá)增加(P＜0.05)

10、；
　　 (2)與PH組相比,ZnPP組肝臟HO-1表達(dá)減少,動(dòng)脈血COHb降低(0.23±0.06％ vs0.50±0.20%,P＜0.05),血清AST水平下降(176.4±32.15IU/L vs209.11±45.77 IU/L,P＜0.05),但仍高于正常組;大鼠肝臟HE染色顯示,ZnPP組匯管區(qū)及中央靜脈周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較PH組明顯減少;
　　 (3)與PH組相比,CoPP組肝臟HO-1表達(dá)進(jìn)一步增加;動(dòng)脈血

11、COHb進(jìn)一步增加(0.83±0.39% vs0.50±0.20%,P＜0.01);血清AST水平進(jìn)一步升高(311.6±60.65IU/L vs209.11±45.77 IU/L,P＜0.05);大鼠肝臟HE染色顯示,CoPP組匯管區(qū)及中央靜脈周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較PH組明顯增加。
　　 3、HO-1在肝硬化門脈高壓大鼠腎臟中的表達(dá)及意義
　　 (1)與SH組相比,PH組腎臟HO-1表達(dá)減少；24小時(shí)總尿量降低(10.93

12、±1.92ml/24 h vs15.00±2.23 ml/24 h,P＜0.05);腎動(dòng)脈血流量顯著下降(3.58±0.04ml/min·100g vs142.86±3.44ml/min·100g,P＜0.05)、血鈉濃度下降(138.75±0.96mmol/L vs142.86±3.44 mmol/L,P＜0.05);肌酐清除率顯著降低(0.12±0.05 ml/min vs0.23±0.02 ml/min,P＜0.05);而腎臟病理

13、顯示除了血管擴(kuò)張和腎間質(zhì)充血,未發(fā)現(xiàn)明顯的腎臟病理改變;
　　 (2)與PH組相比,ZnPP組腎臟HO-1表達(dá)進(jìn)一步減少;腎動(dòng)脈血流量進(jìn)一步降低(3.50±0.08ml/min·100g vs3.58±0.04 ml/min·100g,P＜0.05);24小時(shí)總尿量進(jìn)一步降低(8.50±1.10 ml/24 h vs10.93±1.92 ml/24 h,P＜0.05);血鈉濃度進(jìn)一步降低(136.57±1.40 mmol/L v

14、s138.75±0.96 mmol/L,P＜0.05);肌酐清除率進(jìn)一步下降(0.07±0.01 ml/min vs0.12±0.05 ml/min,P＜0.05);門靜脈壓力和平均動(dòng)脈壓力無(wú)顯著變化;
　　 (3)與PH組相比,CoPP組腎臟HO-1表達(dá)顯著增加;腎動(dòng)脈血流量顯著增加(3.76±0.06 ml/min·100g vs3.58±0.04 ml/min·100g,P＜0.05);24小時(shí)總尿量顯著升高(13.5±1

15、.10ml/24h vs10.93±1.92 ml/24 h,P＜0.05);血鈉濃度顯著增加(142.64±5.43 mmol/L vs138.75±0.96mmol/L,P＜0.05);肌酐清除率略增加(0.14±0.04ml/min vs0.12±0.05 ml/min,P＞0.05);門靜脈壓力和平均動(dòng)脈壓力無(wú)顯著變化。
　　 4、HO-1在肝硬化門脈高壓大鼠肺臟中的表達(dá)及意義
　　 (1)與SH組相比,PH組肺

16、臟HO-1表達(dá)增加;動(dòng)脈血COHb增加(0.50±0.20% vs0.23±0.05,P＜0.01);A-aPO2增加(13.99±2.09 mmHg vs7.72±3.67 mmHg,P＜0.05);肺臟病理顯示肺內(nèi)血管擴(kuò)張;
　　 (2)與PH組相比,ZnPP組肺臟HO-1表達(dá)減少;動(dòng)脈血COHb降低(0.23±0.06% vs0.50±0.20%,P＜0.05);A-aPO2略降低(11.33±2.44 mmHg vs13

17、.99±2.09 mmHg,P＞0.05),但仍高于正常組;肺臟病理顯示肺內(nèi)血管擴(kuò)張程度減輕;門靜脈壓力和平均動(dòng)脈壓力無(wú)顯著變化;
　　 (3)與PH組相比,CoPP組HO-1表達(dá)進(jìn)一步增加;動(dòng)脈血COHb進(jìn)一步增加(0.83±0.39% vs0.50±0.20%,P＜0.01);A-aPO2進(jìn)一步增加(19.56±7.39 mmHg vs13.99±2.09 mmHg,P＜0.05);肺臟病理顯示肺內(nèi)血管擴(kuò)張更加明顯;門靜脈壓

18、力和平均動(dòng)脈壓力無(wú)顯著變化。
　　 結(jié)論:
　　 1、膽管結(jié)扎方法可成功制備肝硬化門脈高壓大鼠模型和肝腎綜合征、肝肺綜合征大鼠模型。
　　 2、在肝硬化門脈高壓階段,HO-1在各臟器表達(dá)不同,具有組織差異性。HO-1在肝臟、肺臟中表達(dá)增加,而在腎臟中表達(dá)減少。
　　 3、在肝硬化門脈高壓階段肝臟HO-1過(guò)度表達(dá)加重肝細(xì)胞損傷,促進(jìn)門脈高壓高血流動(dòng)力循環(huán)變化,加速肝硬化形成。
　　 4、肝硬化門脈高