人超氧化物歧化酶-胸腺素α1在畢赤酵母中的表達(dá)、純化與活性檢測.pdf

1、胸腺素α1(Thymosin alpha-1，Thyα1)是一種小分子活性多肽。體內(nèi)外實驗表明，Thyα1能夠影響細(xì)胞因子的分泌和淋巴細(xì)胞的功能，具有增強(qiáng)抗病毒、抗分支桿菌、抗真菌的能力，誘導(dǎo)抑制腫瘤的免疫活性，被認(rèn)為是具有良好療效的免疫調(diào)節(jié)劑和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(Biological Response Modifier，BRM)。Thyα1作為免疫調(diào)節(jié)劑已廣泛用于各種疾病的治療，如肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、傳染性疾病、感染、

2、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫病、神經(jīng)內(nèi)分泌疾病、各類腫瘤的治療以及化療后的免疫功能的恢復(fù)等。目前生產(chǎn)Thyα1方法有組織提取、化學(xué)合成和基因工程方法合成。臨床使用的Thyα1多為從動物組織提取出的天然產(chǎn)物，純度和活性難以控制，且生產(chǎn)成本昂貴?；蚬こ躺a(chǎn)重組蛋白藥物具有低成本、產(chǎn)物高活性等優(yōu)勢，但是由于Thyα1只有28個氨基酸，用基因工程方法重組表達(dá)時有一定的難度。
　　超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，

3、在體內(nèi)催化超氧陰離子自由基(O2-·)轉(zhuǎn)化為H2O2和O2的反應(yīng)，是生物體內(nèi)防御氧化損傷、抗氧化的生物酶，具有抗衰老、增加機(jī)體免疫等特點，對機(jī)體具有重要的保護(hù)作用。SOD分子量較大，且在酸堿、熱條件下較為穩(wěn)定不易降解。大量試驗和臨床應(yīng)用表明，在各種給藥方式下，SOD毒性和不良反應(yīng)均很小，除罕見的超敏反應(yīng)外，SOD對人體無毒性。因此，超氧化物歧化酶被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、藥品領(lǐng)域，成為理想的對人體有益無害的添加劑。超氧化物歧化酶

4、的基因工程產(chǎn)品也相繼在世界各國被成功開發(fā)生產(chǎn)。
　　考慮到胸腺素α1在體內(nèi)半衰期較短、穩(wěn)定性較差的缺點，同時胸腺素與SOD具有協(xié)同增效作用，為了增強(qiáng)胸腺素α1的穩(wěn)定性和免疫功能，本研究采用了胸腺素α1(Thyα1)與人超氧化物歧化酶(hSOD)融合的策略，構(gòu)建了6His-hSOD-(G4S)1-thyα1和6His-hSOD-(G4S)2-thyα1兩個融合基因，并分別實現(xiàn)了在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的高水平表達(dá)。重組表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過

5、Ni-NTA親和層析純化，獲得純度達(dá)到80％以上重組蛋白。用鄰苯三酚自氧化法和E-玫瑰花法分別測定了人超氧化物歧化酶活性和胸腺素活性?；钚苑治鼋Y(jié)果表明，融合蛋白6His-hSOD-(G4S)1-thyα1和6His-hSO D-(G4S)2-thyα1的超氧化物歧化酶比活性分別為120998U/mg和31279U/mg;融合蛋白在1×10-7 mol/L濃度下的E玫瑰花結(jié)率分別為38.4％和36.6％。結(jié)果說明融合蛋白中由5個氨基酸(G

6、4S)構(gòu)成的連接肽能有效地保障兩個蛋白各自的結(jié)構(gòu)特征，使融合蛋白既有超氧化物歧化酶的活性，又具有胸腺素的活性。
　　纖維素資源是地球上分布最廣、含量最豐富的可再生性碳水化合物，為發(fā)展可再生生物燃料的提供了無盡的原料。木聚糖酶作為半纖維素酶的一種，其應(yīng)用涉及紙漿漂白，動物飼料，生物能源等多個方面的工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動，因此，對木聚糖酶的研究與工業(yè)應(yīng)用開發(fā)一直廣為關(guān)注。天然木聚糖酶往往在耐溫性、最適pH等條件上難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，

7、利用基因工程手段進(jìn)行酶的改造可以改善和提高酶的應(yīng)用價值。
　　11家族木聚糖酶是研究較為廣泛的一類木聚糖酶，目前已有很多不同來源的木聚糖酶基因被克隆、重組表達(dá)，并被解析了三維晶體結(jié)構(gòu)，針對其特點進(jìn)行的蛋白結(jié)構(gòu)改造也被報道。本課題組游淳曾經(jīng)通過定向進(jìn)化和定點突變技術(shù)，獲得并鑒定了該家族來源于Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶C(XynC)的一株突變體。該突變體內(nèi)部疏水核心含有一個點突變(G201C)，導(dǎo)致了

8、突變體的熱穩(wěn)定性明顯提高，同時酶的比活也顯著提高。在該突變體中，201位和50位的半胱氨酸所形成的疏水結(jié)合是導(dǎo)致熱穩(wěn)定性提高的主要原因。在基于XynC的突變體研究中，又得到了熱穩(wěn)定性和酶比活均比原突變體得到提高的新突變體C60A-G201 C。
　　本論文以游淳獲得的突變體C60A-G201C為基礎(chǔ)，利用隨機(jī)突變技術(shù)以及DNA Shuffling技術(shù)獲得了8株突變體;構(gòu)建了含有突變體蛋白基因載體的表達(dá)菌株，成功實現(xiàn)了高水平表達(dá)，并

9、對突變體蛋白進(jìn)行了Ni-NTA親和層析純化;對突變體蛋白進(jìn)行了熱失活常數(shù)的測定，使用圓二色譜技術(shù)對突變體蛋白Tm值進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一株熱穩(wěn)定性得到提高的突變體37，其熱失活常數(shù)要優(yōu)于未突變蛋白，Tm值要高于未突變蛋白6.12℃。通過同源建模對突變體37進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，其序列在20位由Lys突變?yōu)镚lu，而20位突變的Glu與同位于蛋白Fingers區(qū)域的29位的Tyr恰好產(chǎn)生了一個氫鍵，從而穩(wěn)定了蛋白的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了突變體蛋白