重組工程法敲除惡臭假單胞菌KT2440和谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032染色體基因.pdf

1、重組工程(Red/ET, recombination mediated genetic engineering)是指通過(guò)重組酶催化DNA分子之間的同源重組而實(shí)現(xiàn)DNA克隆和DNA修飾一種基因工程手段，是一種新型高效的遺傳工程技術(shù)。其中的重組酶主要是λ噬菌體中redαβ基因表達(dá)的蛋白和Rec前噬菌體中的recET表達(dá)的蛋白。利用重組工程從理論上可以完成對(duì)多種細(xì)菌及真菌中染色體DNA的敲除及修飾，而且通過(guò)重組工程可以避免其他基因敲除方法中要

2、構(gòu)建克隆的步驟，直接進(jìn)行OE-PCR(Overlapextension PCR，重疊延伸PCR)即可獲得重組片段。此種方法最先在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)在經(jīng)過(guò)完善已逐漸在其他細(xì)菌及真菌中實(shí)施。本課題中的惡臭假單胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)是在生物降解及異源表達(dá)中有重要作用的環(huán)境微生物，谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032(Corynebacterium glutamicumATCC13032)是在工業(yè)中發(fā)

3、酵生產(chǎn)各種氨基酸的菌株。隨著這兩種菌株全基因組測(cè)序的完成，對(duì)其基因功能的研究越來(lái)越深入?；蚯贸茄芯炕蚺c蛋白質(zhì)關(guān)系的重要手段，通過(guò)重組工程介導(dǎo)的基因敲除可以實(shí)現(xiàn)兩種菌的高效基因敲除。
　　本文介紹了不同系統(tǒng)的重組工程方法分別對(duì)P.putida KT2440和C.glutamicum ATCC13032進(jìn)行染色體基因敲除。對(duì)P.putida KT2440進(jìn)行基因敲除中共涉及了一種雙質(zhì)粒系統(tǒng)和三種單質(zhì)粒系統(tǒng)，只有雙質(zhì)粒Cre/lo

4、xP系統(tǒng)和一種由丙酮誘導(dǎo)的Cre/loxP單質(zhì)粒系統(tǒng)完成了四種基因的無(wú)標(biāo)記敲除。具體方法是制備含有能夠表達(dá)相關(guān)重組酶基因的質(zhì)粒的P.putida KT2440電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，將通過(guò)OE-PCR獲得的重組片段轉(zhuǎn)入到電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中，驗(yàn)證正確后，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入含有cre基因的質(zhì)粒，進(jìn)行抗性基因的敲除，在此系統(tǒng)中目的基因的無(wú)痕敲除效率最高可以達(dá)到100％;在單質(zhì)粒系統(tǒng)中，第一步

5、的同源重組效率只能達(dá)到雙質(zhì)粒系統(tǒng)的1/5，推測(cè)可能與Cre酶的高本底水平表達(dá)有關(guān)，得到卡那霉素抗性菌株后直接接入含有丙酮的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)一代即可消除抗性基因，雖然敲除效率達(dá)不到雙質(zhì)粒系統(tǒng)的效率，但是操作更加方便簡(jiǎn)潔且適合于高通量操作。對(duì)C.glutamicum ATCC13032進(jìn)行基因敲除中，構(gòu)建了redαβ和 recET兩種重組酶表達(dá)載體，其上包含有同源重組所需的各種重組酶基因，以及雙鏈斷裂修復(fù)過(guò)程中需要的Ⅰ-SceⅠ基因，具

6、體方法是制備含有能夠表達(dá)相關(guān)重組酶基因質(zhì)粒的C.glutamicum ATCC13032電轉(zhuǎn)重組感受態(tài)細(xì)胞，將通過(guò)OE-PCR獲得的重組片段轉(zhuǎn)入重組感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，通過(guò)PCR進(jìn)行驗(yàn)證，獲得含有卡那霉素抗性基因的重組目的菌株。隨后進(jìn)行Ⅰ-SceⅠ介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行第二次同源重組消除抗性基因。用redαβ系統(tǒng)完成了crtI2和upp兩種基因的敲除，用recET系統(tǒng)完成了crtI2、upp和cgp