惡臭假單胞菌KT2440中(p)ppGpp對生物被膜形成的調(diào)控作用.pdf

1、惡臭假單胞菌KT2440是環(huán)境微生物研究中的一株模式菌株，具有普遍認可的生物安全性，多年來作為研究材料被用于研究有機污染物的生物降解、細菌的重金屬耐受性、細菌與植物互作以及細菌生物被膜和游動性調(diào)控等。作為細菌的一種生存策略，形成生物被膜能有效提高細菌的物質(zhì)分解能力和抗逆能力，使細菌對多變的環(huán)境具有更強的適應(yīng)性，因此研究細菌生物被膜的調(diào)控模式對于理解細菌與環(huán)境的關(guān)系具有重要意義。(p)ppGpp是細菌用于響應(yīng)營養(yǎng)饑餓和部分環(huán)境刺激的信號分

2、子，在細胞中具有全局性的調(diào)控作用，對提高細菌在環(huán)境脅迫中的生存能力同樣起到關(guān)鍵性的作用。在多種病原微生物和腸道微生物中，(p)ppGpp對生物被膜的調(diào)控起著重要作用，但是在環(huán)境微生物中卻缺乏相關(guān)的報道。
　　本文研究了(p)ppGpp在KT2440生物形成過程中所發(fā)揮的作用以及胞外多糖Pea的功能和基因的表達調(diào)控，獲得以下結(jié)果:
　　1、KT2440中負責(zé)(p)ppGpp代謝的酶有兩個，分別是具有合成酶活性的RelA和既有弱

3、合成酶活性也有水解酶活性的SpoT。我們發(fā)現(xiàn)單獨缺失relA對KT2440的生物被膜表型不會造成明顯的影響，但是當(dāng)同時敲除relA和spoT，KT2440在固體表面上形成生物被膜的能力顯著增強，但是在氣液界面所形成的生物被膜卻變得松散脆弱，而且經(jīng)過長時間培養(yǎng)后，兩種生物被膜均不能正常消散。此外，relA-spoT突變體在蓋玻片上的粘附能力明顯增強，可是不能正常形成微菌落。
　　生物被膜形成過程中的粘附和發(fā)育以及生物被膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)建均

4、與胞外基質(zhì)中的胞外多糖和粘附蛋白密切相關(guān)。首先通過對多聚糖的定量，我們發(fā)現(xiàn)relA突變體和relA-spoT突變體均能產(chǎn)生更多的多聚糖，雖然relA突變體和relA-spoT突變體的多聚糖總產(chǎn)量相似，但是只有relA-spoT突變體的菌斑變得光滑濕潤，因此造成菌斑形態(tài)變化的原因似乎不是多聚糖總產(chǎn)量的提高，而可能是不同的多糖產(chǎn)量發(fā)生改變。接著我們檢測了四個胞外多糖合成基因簇在突變體中的表達水平，發(fā)現(xiàn)alg表達水平未發(fā)生變化，peb和bcs

5、的表達量有一定程度的上升，但是pea的表達水平卻大幅下降，這些變化在relA-spoT突變體中均比在relA突變體中強烈，推測光滑菌斑的形成是由于缺乏Pea多糖。另外，檢測了粘附蛋白編碼基因lapA和lapF的表達水平后，發(fā)現(xiàn)lapA的表達顯著上升，而lapF呈現(xiàn)相反的趨勢。根據(jù)已知的關(guān)于各個胞外多糖和粘附蛋白的功能，我們認為lapA表達上升是relA-spoT突變體生物被膜增多和粘附能力增強的原因，LapF和Pea的不足可能導(dǎo)致了突變

6、體不能形成微菌落和液面生物被膜結(jié)構(gòu)的缺陷。為了更好地闡述(p)ppGpp對胞外基質(zhì)組分相關(guān)基因表達的影響，我們檢測了與之直接相關(guān)的調(diào)控因子的表達變化，發(fā)現(xiàn)在relA-spoT突變體中fleQ的表達顯著上升，而rpoS則是顯著下降。在缺乏(p)ppGpp的情況下，σ因子RpoS的表達和功能發(fā)揮受抑制，導(dǎo)致lapF表達下降，同時促進了轉(zhuǎn)錄上依賴σ因子RpoD的fleQ表達，表達量上升的FleQ促進lapA的轉(zhuǎn)錄，雖然FleQ能抑制bcs的表

7、達，但是高水平c-di-GMP能解除這種抑制作用，促進bcs表達。
　　2、有研究顯示Pea多糖與生物被膜的穩(wěn)定性和液面生物被膜的形成有關(guān)，但是pea的表達模式至今未被闡明。為了更好地解釋生物被膜表型和pea表達水平在relA-spoT突變體中的變化，我們探究了Pea的功能與基因的表達調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)pea基因簇從一個位點開始轉(zhuǎn)錄，該轉(zhuǎn)錄起始位點位于基因簇首個基因的起始密碼子前面25bp，隨后發(fā)現(xiàn)pea的轉(zhuǎn)錄依賴于σ因子RpoS，推

8、測pea在relA-spoT突變體中的表達下降是RpoS的表達水平降低所致。在rpoS突變體中，另一個σ因子似乎也能介導(dǎo)pea轉(zhuǎn)錄，可是此時pea的轉(zhuǎn)錄水平非常低，根據(jù)點突變啟動子轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果，這個σ因子極可能是RpoD。生物被膜的檢測結(jié)果顯示，缺失pea雖然不影響生物被膜形成的初始階段，但在后續(xù)階段影響了生物被膜的發(fā)育，使生物被膜產(chǎn)量相對降低。另外，pea突變體完全喪失了形成液面生物被膜的能力，雖然lapF也是一個轉(zhuǎn)錄依賴于RpoS

9、的胞外基質(zhì)基因，但是lapF突變體的生物被膜表型與野生型菌株的相比沒有明顯差異，表明影響液面生物被膜形成的關(guān)鍵基質(zhì)成分是Pea而不是LapF，并且relA-spoT突變體氣液界面生物被膜的缺陷很可能是因為Pea多糖在該突變體中的產(chǎn)量降低。Pea多糖還是形成由高水平c-di-GMP介導(dǎo)的褶皺菌斑的必要因素，含高水平c-di-GMP的rpoS突變體也能形成褶皺菌斑，但是比野生型菌株的明顯要弱，這可能是由于RpoD也能激活pea低水平的表達，