大豆Na+-H+反向轉(zhuǎn)運蛋白編碼cDNA的克隆及耐鹽轉(zhuǎn)基因百脈根和紫花苜蓿的獲得.pdf

1、土壤鹽漬化是抑制植物生長、降低作物產(chǎn)量的主要因子之一。鹽對于植物的毒害作用主要是由于水分虧缺導(dǎo)致的滲透脅迫以及過量的Na+對重要生化過程的毒害。植物克服鹽脅迫的主要機制是Na+的外排和液泡區(qū)室化。質(zhì)膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白利用質(zhì)膜ATPase產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子梯度將Na+排出細胞，減少Na+向葉片中的長距離轉(zhuǎn)運而保護光合組織免受鹽的毒害。液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白則利用液泡膜質(zhì)子泵(H+-ATPase和H+-PPase)產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子

2、梯度將Na+區(qū)室化進入液泡，不僅減輕了過多Na+的累積對細胞質(zhì)的毒害，而且可以利用NaCl作為溶質(zhì)維持滲透勢以驅(qū)動水分進入細胞。因此，膜定位的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白和質(zhì)子泵在植物耐鹽中發(fā)揮著重要作用。已有諸多研究表明，通過基因工程手段提高該類蛋白的表達量是提高植物耐鹽性的有效途徑之一。
　　 本研究首先從大豆(Glycine max L)中克隆到了液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因(GmNHX1)的全長cDNA。該cDNA

3、序列包括5’端非翻譯區(qū)464bp，編碼區(qū)1641bp，3’端非翻譯區(qū)486bp，共2591bp。推斷其編碼的蛋白共546個氨基酸，具有典型的液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白特征，與已知功能的液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白AtNHX1、OsNHX1、AgNHX1具有較高的同源性，分別達75.8％、75.3％、78％。GmNHX1在大豆基因組中為單拷貝基因，其表達具有組織特異性，并能受到NaCl、KCl、LiCl、ABA以及脫水脅迫的上調(diào)；此

4、外，其在不同組織中的表達差異還與品種的耐鹽性有關(guān)，耐鹽品種GmNHX1的轉(zhuǎn)錄水平在葉片中低于，而在根系和下胚軸中均高于敏鹽品種。這些結(jié)果暗示著本研究中克隆的大豆GmNHX1基因與大豆的耐鹽性相關(guān)。
　　 在建立和優(yōu)化了兩種優(yōu)質(zhì)豆科牧草--百脈根和紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功地進行了擬南芥AVP1基因、大豆GmNHX1基因的過表達研究，不僅獲得了耐鹽性提高的T1代過表達AVP1的轉(zhuǎn)基因百脈根株系，也進

5、一步證明了大豆GmNHX1在耐鹽性中的作用。而且，對過表達AVP1及過表達GmNHX1的百脈根進行Na+、K+含量測定發(fā)現(xiàn)，與預(yù)期相反，兩種轉(zhuǎn)基因株系與對照相比，在鹽脅迫條件下均具有較低的Na+含量和較高的K+/Na+比率，顯示了百脈根中過表達擬南芥AVP1及大豆GmNHX1所導(dǎo)致的耐鹽性提高與減少轉(zhuǎn)基因植物中Na+的積累有密切關(guān)系。GmNHX1在紫花苜蓿中過表達，也有效提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性。
　　 耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因豆科牧