耐鹽根瘤工程菌的獲得及接種后對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響.pdf

1、近年來(lái)，應(yīng)用基因工程手段改造自然界中現(xiàn)有根瘤菌的某些遺傳性狀，如結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)力、固氮酶活性、吸氫酶活性、耐氨、耐鹽性等，已經(jīng)成為生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的一個(gè)重要研究方向。而構(gòu)建高效耐鹽的根瘤菌工程菌株，提高根瘤菌耐鹽水平，為生物肥料的研制奠定基礎(chǔ)則具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 本研究以啤酒酵母為材料，利用PCR技術(shù)分離得到耐鹽基因HAL1，其編碼框全長(zhǎng)885bp，編碼294個(gè)氨基酸。將HAL1插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的EcoRI和

2、XhoI位點(diǎn)中間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)三親雜交導(dǎo)入苜蓿根瘤菌得到耐鹽工程菌株。用此工程菌接種紫花苜蓿，研究了接種后對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響。 主要取得以下研究結(jié)果： 1.工程菌中的重組質(zhì)粒在自生培養(yǎng)條件下傳代的穩(wěn)定性：將純化的工程菌在YMA培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接5次后檢測(cè)其丟失率，結(jié)果表明在無(wú)抗性選擇的情況下，連續(xù)轉(zhuǎn)接重組質(zhì)粒基本沒(méi)丟失，證明重組質(zhì)粒pGEX-HAL1在苜蓿根瘤菌中能夠穩(wěn)定存在和遺傳。 2.工程菌中融合蛋白：提

3、取工程菌中的融合蛋白并進(jìn)行純化，結(jié)果表明當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為3h，IPTG濃度是1 mmol/L 時(shí)，融合蛋白產(chǎn)量最多。1ml培養(yǎng)物中產(chǎn)生的融合蛋白大約有3mg，純化蛋白占可溶總蛋白的1.56％。 3.工程菌在不同鹽濃度培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況：把苜蓿根瘤空白菌和攜帶 HAL1的工程菌分別接在含3％、5％、7％和9％NaCl的YMA培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，在相同鹽濃度的培養(yǎng)基中，工程菌的OD<,600>值都大于對(duì)照，說(shuō)明工程菌的生長(zhǎng)狀態(tài)好于空白菌

4、。 4.將苜蓿種在不同鹽濃度的培養(yǎng)基中，然后用根瘤工程菌和根瘤空白菌接種，結(jié)果表明，工程菌接種后的植株在不同鹽濃度培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況均比對(duì)照好。30d后空白菌接種的對(duì)照植株已經(jīng)枯萎死亡，但工程菌接種的植株還明顯帶有綠色，由此可見(jiàn)工程菌接種后可提高苜蓿的耐鹽水平。 5.工程菌的促生作用：把苜蓿種在滅菌沙土中，定期澆無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液，待苜蓿長(zhǎng)出第一片真葉時(shí)，分別接種工程菌和根瘤空白菌，40d后觀察苜蓿的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明用工程菌接