Calpain-calpastatin系統(tǒng)在梗死后心肌重構(gòu)中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　心肌梗死(myocardial infarction，MI)是由于冠狀動脈血供急劇減少或者中斷，引起相應(yīng)的心肌缺血、缺氧，最終導(dǎo)致心肌壞死。心肌梗死后主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、凋亡，同時伴隨著大量纖維細(xì)胞增殖、纖維細(xì)胞替代壞死的心肌細(xì)胞，引起心肌重構(gòu)的發(fā)生，最終發(fā)展為失代償性心力衰竭而導(dǎo)致死亡。心肌梗死是一種常見的心血管疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康，雖然近幾十年來各種新藥的研發(fā)和介入手術(shù)的開展，其并發(fā)癥和死亡率大大降低，但

2、是心肌梗死后引起的心肌重構(gòu)，導(dǎo)致的心力衰竭仍在呈慢性進(jìn)行性發(fā)展，最終走向終末期心力衰竭。鈣蛋白酶(calpains)是一類存在于細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，包括14種亞型，其中以calpain-1和calpain-2表達(dá)最為廣泛，兩者的激活均依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，且均可被鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)所拮抗。近年研究表明，calpains的激活在心肌細(xì)胞肥大和凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，且calpains的表達(dá)情況與心

3、力衰竭的程度呈正相關(guān)，然而calpains在心肌梗死后心肌重構(gòu)中的作用及分子機(jī)制尚不清楚，且過表達(dá)calpastatin在心肌梗死后心肌重構(gòu)過程中的作用報道甚少。故提出如下假設(shè):calpains的激活在心肌梗死后心肌重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，過表達(dá)其抑制因子calpastatin后可抑制正常心肌骨架結(jié)構(gòu)的降解和異常纖維組織的沉積。
　　目的:
　　以過表達(dá)的calpastatin轉(zhuǎn)基因型小鼠為研究對象，評估過表達(dá)calpastat

4、in抑制calpains后對心肌梗死后心肌重構(gòu)過程的影響，旨在探討calpain/calpastatin系統(tǒng)在梗死后心肌重構(gòu)中的作用及分子機(jī)制。
　　方法:
　　1、Calpastatin轉(zhuǎn)基因型小鼠的構(gòu)建、鑒定及繁殖;
　　以C57BL/6J小鼠為遺傳背景，采用人的calpastatin基因為靶基因，構(gòu)建過表達(dá)calpastatin的轉(zhuǎn)基因型小鼠。利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建“pRP.EX3d-EF1A-CAST-

5、IRES-eGFP”目的載體，并將目的基因片段溶于顯微注射緩沖液中，通過顯微注射法把目的基因注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，并將其胚胎移植到同期發(fā)情的假孕受體母鼠的輸卵管內(nèi)，獲得子代小鼠。采用PCR方法鑒定出陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，確定其首建鼠，并通過與野生型C57BL/6J小鼠回交數(shù)代后再互交數(shù)代建系。
　　2、使用電子稱稱量野生型小鼠與轉(zhuǎn)基因型小鼠的體重，使用羅氏血糖儀檢測小鼠的空腹血糖，采用直接法或酶法檢測小鼠的血糖;
　

6、　3、采用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)基因型小鼠各組織中calpastatin mRNA的表達(dá)情況;
　　4、采用RT-PCR法檢測野生型小鼠與轉(zhuǎn)基因型小鼠內(nèi)源性calpastatinmRNA的表達(dá)情況;
　　5、采用Western blotting法檢測野生型小鼠與轉(zhuǎn)基因型小鼠心臟組織中calpastatin蛋白的表達(dá)情況;
　　6、制備小鼠的心肌梗死模型及各組小鼠分組情況;
　　選用SPF級野生型和轉(zhuǎn)基因型C57BL

7、/6雄性小鼠（周齡為6-8周、體重為18-24g），隨機(jī)分為:(1)野生型假手術(shù)組(WT+Sham)20只;(2)野生型手術(shù)組(WT+MI)30只;(3)轉(zhuǎn)基因型假手術(shù)組(TG+Sham)20只;(4)轉(zhuǎn)基因型手術(shù)組(TG+MI)28只。通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法構(gòu)建心肌梗死模型。手術(shù)組為結(jié)扎左冠狀動脈前降支;而假手術(shù)組不結(jié)扎左冠狀動脈前降支，其余操作同手術(shù)組。術(shù)后各組小鼠均正常飲食、飲水，連續(xù)喂養(yǎng)21天，檢測以下各項指標(biāo)。

8、　　7、造模后連續(xù)觀察21天，計算各組小鼠的生存率;
　　8、采用多道生理記錄儀測量造模21天后各組小鼠的血流動力學(xué)情況;
　　小鼠麻醉后行右頸動脈插管，記錄介入頸動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動脈壓(MAP);插管進(jìn)入左心室后記錄心室壓力變化曲線，根據(jù)Labchart7.0分析出左室收縮末壓(LVESP)、左室舒張末壓(LVEDP)和最大及最小左室壓力變化率（±dP/dtmax）。
　　9、使用電子稱稱

9、量造模21天后各組小鼠及心臟的重量，計算心臟重量指數(shù)（心臟重量/體重）及觀察心臟大體形態(tài);
　　10、采用Evans Blue染色比較造模24小時后各組小鼠心肌梗死情況，采用HE染色比較造模21天后各組小鼠心肌梗死情況及室間隔心肌細(xì)胞的大小;
　　11、采用Masson三色染色比較造模21天后各組小鼠膠原纖維含量及分布情況;
　　12、采用免疫組化法比較造模21天后各組小鼠Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維的含量;
　　13、采

10、用熒光定量試劑盒檢測造模21天后各組小鼠鈣蛋白酶的活性;
　　14、采用Western blotting法檢測造模21天后各組小鼠鈣蛋白酶系統(tǒng)（calpain-1、calpain-2、calpastatin）及基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)（MMP-2、MMP-9、TFGβ、TIMP-1、TIMP-2）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、將90枚具有活性的注射卵移植至3只假孕母鼠輸卵管中，3只母鼠均懷孕，移植成功率為100％;共產(chǎn)下

11、23只小鼠，經(jīng)PCR鑒定后，2只小鼠為轉(zhuǎn)基因陽性的首建小鼠，陽性率為9％。
　　2、同期的野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因型小鼠的體重、血糖、血脂無明顯差異（P＞0.05）。
　　3、轉(zhuǎn)基因型小鼠各組織中calpastatin mRNA的表達(dá)情況:轉(zhuǎn)基因型小鼠的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、骨骼肌和腦組織中均有calpastatinmRNA的表達(dá)。
　　4、內(nèi)源性calpastatin mRNA的表達(dá)情況:與野生型比較，轉(zhuǎn)基因型小鼠

12、內(nèi)源性calpastatin mRNA的表達(dá)量無明顯差異（P＞0.05）。
　　5、心臟組織中calpastatin蛋白的表達(dá)情況:與野生型相比，轉(zhuǎn)基因型小鼠心臟中calpastatin蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。
　　6、造模21天后，生存率觀察結(jié)果:與野生型相比，轉(zhuǎn)基因型小鼠的生存率無明顯差異（P＞0.05）。
　　7、造模21天后，血流動力學(xué)觀察結(jié)果:與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠的SBP、DBP、MAP

13、、LVESP、dP/dtmax、dP/dtmin均顯著降低（P＜0.01），LVEDP顯著升高（P＜0.01）;在手術(shù)組中，與野生型比較，轉(zhuǎn)基因型小鼠的SBP、DBP、MAP、LVESP、dP/dtmax、dP/dtmin升高（P＜0.05或P＜0.01），LVEDP顯著降低（P＜0.01）。
　　8、造模21天后，心臟重量指數(shù)（心臟重量/體重）觀察結(jié)果:與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠的心臟重量指數(shù)顯著升高（P＜0.01）;在手術(shù)組中

14、，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因型小鼠心臟重量指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。
　　9、心肌梗死面積觀察結(jié)果:心肌梗死24小時后，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因型小鼠的心梗面積無明顯差異（P＞0.05）;心肌梗死21天后，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因型小鼠的心梗死面積顯著降低（P＜0.01）。
　　10、造模21天后，組織學(xué)及病理學(xué)觀察結(jié)果:與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠的心肌細(xì)胞顯著肥厚，梗死區(qū)、交界區(qū)和非梗死區(qū)的膠原纖維含量顯著增多（P＜0.01）;在手

15、術(shù)組中，與野生型比較，轉(zhuǎn)基因型小鼠的心肌細(xì)胞肥厚顯著降低，梗死區(qū)、交界區(qū)和非梗死區(qū)的膠原纖維含量顯著降低（P＜0.01）。類似的，通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠梗死區(qū)、交界區(qū)和非梗死區(qū)的Ⅰ型膠原和Ⅲ膠原纖維含量顯著增多(P＜0.01);在手術(shù)組中，與野生型比較，轉(zhuǎn)基因型小鼠梗死區(qū)、交界區(qū)和非梗死區(qū)的Ⅰ型膠原和Ⅲ膠原纖維含量顯著降低（P＜0.01）。
　　11、造模21天后，鈣蛋白酶活性情況:與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠

16、的鈣蛋白酶活性明顯升高（P＜0.01）;在手術(shù)組中，與野生型比較，轉(zhuǎn)基因型小鼠的鈣蛋白酶活性明顯降低（P＜0.01）。
　　12、造模21天后，鈣蛋白酶系統(tǒng)及基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)的蛋白表達(dá)情況:與假手術(shù)組比較，手術(shù)組小鼠的calpain-1、calpain-2、MMP-2、MMP-9、TFGβ均顯著升高（P＜0.01），calpastatin、TIMP-1、TIMP-2均顯著降低（P＜0.01）;在手術(shù)組中，與野生型比較，轉(zhuǎn)基因型小

17、鼠的calpain-1、calpain-2、MMP-2、MMP-9、TFGβ均顯著降低（P＜0.01），calpastatin、TIMP-1、TIMP-2均顯著升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、在轉(zhuǎn)基因型小鼠體內(nèi)，轉(zhuǎn)錄外源性人的calpastatin基因不會對小鼠內(nèi)源性calpastatin基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。
　　2、轉(zhuǎn)基因型小鼠不會影響小鼠的生長及體內(nèi)的糖脂代謝。
　　3、心肌梗死后calpains