熱穩(wěn)定性O(shè)型口蹄疫基因工程病毒的構(gòu)建及其特性分析.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease Virus，F(xiàn)MDV)引起豬、牛和羊等偶蹄動物感染的一種重大烈性傳染病，是《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020)》中的三個單列病種之一。目前，滅活疫苗的免疫接種是預(yù)防、控制和凈化口蹄疫的主要手段。但口蹄疫病毒對熱極其敏感（尤其是O型口蹄疫病毒），溫度升高容易誘導(dǎo)病毒粒子解離成五聚體亞單位(12S)而導(dǎo)致

2、疫苗的有效抗原(146S)含量降低，從而影響疫苗的免疫保護效力，進(jìn)而影響口蹄疫的有效防控。因此，面對目前的市場需求，急需發(fā)展一種耐熱特性優(yōu)良的口蹄疫鑒別診斷疫苗，有效提升我國口蹄疫疫苗質(zhì)量，滿足國家口蹄疫免疫凈化防控的技術(shù)需求。為了發(fā)展熱穩(wěn)定的口蹄疫鑒別診斷疫苗候選毒株，本論文從以下3部分進(jìn)行研究:
　　1.以實驗室構(gòu)建的免疫原性優(yōu)良的O型口蹄疫標(biāo)記病毒感染性克隆pO/TAA為骨架，在結(jié)構(gòu)蛋白引入單個或多個氨基酸突變，分別構(gòu)建了1

3、0種基因修飾的口蹄疫全長重組質(zhì)粒。全長質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ線化后分別轉(zhuǎn)染表達(dá)T7RNA聚合酶的BSR/T7細(xì)胞，共成功拯救了9株重組病毒。對重組病毒進(jìn)行RT-PCR測序和間接免疫熒光鑒定，結(jié)果證明拯救的6株口蹄疫重組病毒(rvO/EN、rvO/ER、rvO/FH、rvO/FI、rvO/FN、rvO/FO)含預(yù)期的氨基酸突變。
　　2.在不同溫度和pH=60條件下對重組病毒進(jìn)行熱和酸解離實驗，結(jié)果表明三株重組病毒(rvO/EN、rvO/F

4、N、rvO/FO)的熱和酸穩(wěn)定性明顯優(yōu)于親本病毒。重組病毒的一步生長曲線、噬斑特性分析結(jié)果顯示在結(jié)構(gòu)蛋白引入不同的氨基酸突變會不同程度的影響病毒的復(fù)制能力和噬斑表型。遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，重組病毒在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳8代，一個重組病毒(rvO/EN)引入的氨基酸發(fā)生了部分的回復(fù)，另五個病毒中引入的氨基酸穩(wěn)定存在。
　　3.選取三株熱穩(wěn)定性優(yōu)良的重組病毒制備滅活疫苗免疫豬，每隔一周采血制備血清，用病毒中和實驗分析結(jié)構(gòu)蛋白氨基