O型口蹄疫與偽狂犬病二價基因工程疫苗的研究.pdf

1、口蹄疫(FootandMouthDiseaseFMD)是由口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirusFMDV)引起的偶蹄動物急性、熱性、高度接觸性傳染病，是危害畜牧業(yè)最嚴重的傳染病之一，也是造成家畜及其產品國際貿易受阻的重要疾病，被國際獸醫(yī)局(OIE)和聯(lián)合國糧農組織(FAO)在國際動物衛(wèi)生法典中列為18種A類傳染病之一，近年又被列為重大跨國動物疫病的全球消滅計劃及生物武器安全公約組織重點檢查對象。中國政府公布的《動物

2、病原微生物分類明錄》將口蹄疫病毒列為十種一類動物病原微生物之一。FMDV屬于小RNA病毒科(Picomaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，有七個血清型，分別為A、O、C、Asial和南非SAT1、SAT2、SAT3，每種血清型里又可分為許多亞型，不同血清型之間沒有交叉保護力，其中O型口蹄疫分布最廣，在非洲、南亞、中東和南美許多國家廣泛分布，在我國的口蹄疫病例大多都是O型口蹄疫。免疫預防接種是控制乃至消滅口蹄疫的主要

3、措施，目前使用O型口蹄疫滅活疫苗預防該病，取得了一定的效果，但是仍需改進。 本研究以偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)基因缺失株TK-/gE-/LacZ+為載體，融合表達具有免疫增強作用的牛皰疹病毒I型VP22基因和O型FMDV的主要抗原基因P1或P1/2A/3C，構建了基因工程二價疫苗株，達到一針預防兩種疾病的目的。同時以pcDNA3.1(+)為載體構建了DNA疫苗pcDNA-VP22-P1和pcDNA-

4、VP22-P1/2A/3C。用Balb/c小鼠模型比較了重組病毒TK-/gE-/VP22-P1、TK-/gE-/VP22-P1/2A/3C和DNA疫苗pcDNA-VF22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C及豬口蹄疫O型滅活疫苗的免疫效果。 1.牛皰疹病毒I型VP22基因、O型口蹄疫病毒P1和P1/2A/3C基因的克隆與序列分析為了將VP22基因分別與FMDV的P1基因和P1/2A/3C基因的5’端按照正確的閱讀框架融

5、合，首先設計一對分別含有HindIII和EcoRV酶切位點的上、下游引物，從含有牛皰疹病毒I型VP22基因的重組質粒中擴增出不含終止密碼子的牛皰疹病毒I型VP22基因編碼區(qū)；再用分別含有EcoRV和XbaI酶切位點的上、下游引物，從含有O型FMDVP1基因和P1/2A/3C基因的重組質粒中分別擴增出不含起始密碼子的P1基因和P1/2A/3C基因；將擴增的VP22基因、P1基因和P1/2A/3C基因，分別克隆到pMD18-T載體，獲得重組

6、質粒pMD18-T-VP22、pMD18-T-P1和pMD18-T-P1/2A/3C。DNA測序結果表明，三個基因的序列與已經公布的序列完全一致。 2.共表達牛皰疹病毒I型VP22基因和O型口蹄疫病毒主要免疫原性基因的DNA疫苗的構建及其免疫原性的效果用HindIII和EcoRV酶切pMD18-T-VP22后，凝膠回收VP22基因，并定向克隆到真核表達質粒pcDNA3.1(+)的HindIII和EcoRV酶切位點之間，獲得重組質

7、粒pcDNA-VP22；將pMD18-T-P1和pMD18-T-P1/2A/3C分別用EcoRV和XbaI酶切后凝膠回收，回收片段分別定向克隆到pcDNA-VP22的EcoRV和XbaI酶切位點之間，使其與VP22的3’端融合，分別獲得重組表達質粒pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C。然后用Balb/c小鼠模型評價了pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C兩種DNA疫苗及本實驗室以

8、前構建的不含VP22的DNA疫苗pcDNA-P1和pcDNA-P1/2A/3C的免疫效果。結果顯示，首免后14天和28天，四種DNA疫苗均產生了可以檢測到的FMDVELISA抗體和中和抗體；含VP22的DNA疫苗(pcDNA-VP22-P1、pcDNA-VP22-P1/2A/3C)的抗體水平在二免后顯著高于不含VP22的DNA疫苗(pcDNA-P1、pcDNA-P1/2A/3C)(P<0.05)；DNA疫苗與FMDV滅活疫苗聯(lián)合免疫的抗

9、體水平顯著高于DNA疫苗單獨免疫(P<0.05)，但與FMDV滅活疫苗單獨免疫沒有顯著差異(P>0.05)。淋巴細胞增殖試驗結果顯示，DNA疫苗誘導細胞免疫的水平遠遠高于FMDV滅活疫苗(P<0.05)。 3.共表達牛皰疹病毒I型VP22基因和O型口蹄疫病毒多抗原表位的重組偽狂犬病毒的構建及其免疫應答利用通用轉移載體pIECMV，構建了轉移載體pIECMV-VP22-P1和pIECMV-VP22-P1/2A/3C。以PRVTK-

10、/gE-/LacZ+為親本株，分別構建了融合表達VP22-P1和VP22-P1/2A/3C的重組病毒TK-/gE-/VP22-P1和TK-/gE-/VP22-P1/2A/3C，經空斑純化、PCR和Southern雜交鑒定，獲得了純化的病毒。Westernb1ot證實VP22-P1和VP22-P1/2A/3C在重組偽狂犬病毒中得到表達。檢測了重組病毒的遺傳穩(wěn)定性和增殖滴度。用該重組病毒免疫Balb/c小鼠，并與親本株和O型口蹄疫滅活苗進行

11、比較。結果顯示，無論是TK-/gE-/VP22-P1疫苗免疫組，還是TK-/gE-/VP22-P1/2A/3C疫苗免疫組，其FMDV的ELISA抗體水平均與FMDV滅活疫苗免疫組的抗體水平相當，顯著不差異(P>0.05)，說明利用偽狂犬病毒融合表達VP22-P1和VP22-P1/2A/3C能激發(fā)很好的免疫反應。 綜上所述，本研究成功構建了融合表達牛皰疹病毒I型VP22基因與O型口蹄疫病毒P1基因或P1/2A/3C基因的DNA疫苗