TGEV S蛋白D位點(diǎn)和胞壁酰二肽及促吞噬素在干酪乳桿菌中的表達(dá)和免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)能夠引起不同年齡和品種的豬發(fā)生以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水為特征的胃腸炎，該病是一種高度傳染性病毒性腸道疾病，兩周齡以內(nèi)的仔豬致死率可達(dá)100％。黏膜免疫是對(duì)本病免疫保護(hù)的最佳途徑。本研究選用TGEVS蛋白中能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的非糖基化的線性表位D抗原位點(diǎn)作為靶基因片段，通過乳酸菌系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，同時(shí)選擇胞壁酰二肽和

2、促吞噬素與D位點(diǎn)共表達(dá)，分析評(píng)價(jià)其對(duì)特異性免疫應(yīng)答的影響。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）和促吞噬素(Tuftsin)二十聚體(20MT)進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，串聯(lián)形成四十聚體(40MT)。分別將20MT和40MT與6D相連，然后將6D、20MT-6D和40MT-6D分別克隆到pPG612載體中，電轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽(yáng)性重組菌，分別命名為rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶

3、pPG612-20MT-6Ds、rLc∶pPG612-40MT-6Ds。
　　 將重組菌rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds在2％ D-木糖MRS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后，進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果表明:目的蛋白獲得表達(dá)，蛋白大小分別為27kDa、43kDa、59kDa，符合預(yù)期大小;取誘導(dǎo)后的培養(yǎng)上清，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，三組重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后，目

4、的蛋白均獲得了分泌表達(dá)。將6-8周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組，每組12只，口服免疫，分別為鮮奶對(duì)照組、rLc∶pPG612組、rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds組?？诜庖呋罹繛?09個(gè)/只，連續(xù)三天灌服，每隔1周加強(qiáng)免疫一次，共免疫三次。分別于免疫前和免疫后定期采集各組血清、糞便、淚液、鼻黏液、外生殖道黏液。通過間接ELISA檢測(cè)，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表

5、明，rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds免疫組特異性IgA和IgG抗體水平均明顯高于rLc∶pPG612-6Ds，且rLc∶pPG612-20MT-6Ds免疫組抗體水平要高于rLc∶pPG612-40MT-6Ds免疫組。細(xì)胞中和試驗(yàn)結(jié)果表明，rLc∶pPG612-6Ds，rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds組免疫小鼠所得血清的中和效價(jià)分別為1∶15、1∶

6、32和1∶60，腸黏膜抗體IgA中和效價(jià)分別為1∶32、1∶51和1∶64。研究結(jié)果表明，口服免疫表達(dá)6Ds、20MT-6D和40MT-6Ds蛋白的重組乳酸菌均能誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)免疫和黏膜免疫，經(jīng)口服免疫后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的黏膜免疫反應(yīng)不僅局限于胃腸道，還可以誘導(dǎo)其他黏膜部位產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。
　　 將新分離的免疫鼠脾細(xì)胞稀釋成5×106個(gè)/mL,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th細(xì)胞亞類Th1、Th2、Th17和Treg，分析MT在Th細(xì)胞水平上對(duì)

7、免疫調(diào)節(jié)的作用途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6D組的Th1、Th2和Th17相對(duì)于rLc∶pPG612-6D組和rLc∶pPG612組有明顯的增高，且差異極顯著。rLc∶pPG612-20MT-6Ds組的Th亞類細(xì)胞都明顯高于rLc∶pPG612-40MT-6D組，且差異極顯著。rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6D組Th1/Th2細(xì)胞均

8、發(fā)生明顯平衡漂移，分析確定MT為Th1類型佐劑。同時(shí)，檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞水平，結(jié)果表明:rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds三組的Th17細(xì)胞水平相對(duì)于rLc∶pPG612明顯上調(diào)，且差異極顯著，rLc∶pPG612-40MT-6Ds組顯著高于rLc∶pPG612-20MT-6Ds組。rLc∶pPG612-20MT-6Ds組和rLc∶pPG612-40MT-

9、6Ds組的Treg細(xì)胞水平相對(duì)于對(duì)照組rLc∶pPG612和rLc∶pPG612-6Ds組明顯降低，且差異極顯著。rLc∶pPG612-40MT-6Ds組的Treg細(xì)胞水平與rLc∶pPG612-20MT-6Ds組相比，下降更明顯，且差異極顯著。以上結(jié)果表明:MT為Th1型免疫增強(qiáng)劑，不僅可以增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答水平，同時(shí)也具有調(diào)節(jié)免疫機(jī)制和抗免疫抑制的作用。
　　 綜上所述，本研究重組的干酪乳桿菌不僅誘導(dǎo)產(chǎn)生了體液免疫和黏膜免疫