18個野生靈芝菌株的分離鑒定及其特性研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma lucidum)，屬真菌界（Kingdom Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes），多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，靈芝屬(Ganoderma)。在我國已經(jīng)有兩千多年的藥用歷史，被中醫(yī)家視為補(bǔ)中益氣、滋補(bǔ)強(qiáng)體、扶正固本、延年益壽等功效的上等良藥。
　　本研究對采集自福建、廣東、廣西、江蘇、吉林的野生靈芝進(jìn)行分

2、離鑒定和藥用成分分析。對野生靈芝菌株進(jìn)行ITS鑒定，分析其生物學(xué)特性和遺傳親緣關(guān)系，研究菌株有效成分含量的差異，比較栽培和野生靈芝子實體的差異，挖掘利用靈芝的價值。本研究主要做了以下工作：
　　1本研究從福建、廣東、廣西、江蘇、吉林采集分離了18個野生靈芝菌株，其子實體形態(tài)可分為4類，可能為赤芝、紫芝、重傘靈芝和彎柄靈芝（或喜熱靈芝或海南靈芝）。采用ITS測序初步分類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生靈芝菌株的ITS序列片段大小在500-750

3、bp，可以分為6大類：G. lucidun（赤芝）9個、G. sinense（紫芝）2個、G. tsugae（松杉靈芝）1個、G. flexipes（彎柄靈芝）1個、G. multipileum（重傘靈芝）3個以及G. sp2個。
　　2對野生菌株進(jìn)行ITS-RFLP和ISSR分子標(biāo)記分析。分別用HaeIII和MspI酶切ITS序列，結(jié)合克隆測序得到ITS序列的酶切片段，將18個靈芝菌株分為6類，結(jié)果和ITS的聚類一致。用篩選出的

4、8個ISSR引物分析收集的靈芝，構(gòu)建親緣關(guān)系圖譜，結(jié)果表明親緣系數(shù)為0.7時，菌株被分為6大類，呼應(yīng)了ITS聚類和ITS-RFLP分類結(jié)果。同時發(fā)現(xiàn)菌株SL9和SL10是相同菌株，驗證兩者無拮抗反應(yīng)；親緣系數(shù)為0.64時，G. sp與G. lucidun聚為一類。赤芝的親緣關(guān)系表明，地理距離近的菌株親緣關(guān)系較近。
　　3分析野生靈芝菌株的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)不同靈芝菌種的差異較大。G.tsugae和G. sp的菌絲形態(tài)與其他菌種區(qū)別明

5、顯；無論在PDA培養(yǎng)基還是木屑培養(yǎng)基中，G. multipileum的生長速度都是最快的，G. tsugae和G. flexipes的均很慢。生長溫度結(jié)果表明，G. tsugae的適溫是20℃，為耐低溫菌株；G. multipileum-Y1的適溫是34℃，為耐高溫菌株。赤芝種內(nèi)，菌株WX和NZ的適溫也是34℃，生長速度快，且菌株NZ比較耐酸性生長，可作為遺傳育種材料。
　　4靈芝野生菌株和主栽品種出芝試驗，比較不同靈芝菌株的農(nóng)藝

6、性狀，發(fā)現(xiàn)不同靈芝菌種的子實體形態(tài)大同小異。G. multipileum的菌株LQ和Y1單袋產(chǎn)量較高，且菌株LQ的產(chǎn)孢量較高，菌蓋似如意，適合栽培馴化；G. flexipes和G. sp的產(chǎn)量一般；但G. tsugae和G. sinense未如期出芝。赤芝的單袋產(chǎn)量高，其中菌株ZK最高，達(dá)17.60 g；赤芝菌株SL9和SL6的產(chǎn)量較高，且SL6周期短，產(chǎn)孢量多，可進(jìn)一步觀察作為育種材料。
　　5比較靈芝子實體有效成分含量，G.

7、flexipes-SC子實體多糖和三萜含量高，其中多糖含量為23.70 mg/mL，但是三萜酸成分和含量較少；G. sp-YX和G. sp-ZJ的子實體三萜含量高，且三萜酸成分和含量都極豐富，可用于多糖或三萜的提取生產(chǎn)。此外，研究發(fā)現(xiàn)子實體三萜的HPLC圖譜可用于G. flexipes、G. multipileum、G. lucidun和G. sp的鑒定分類。赤芝菌株中，產(chǎn)量高的菌株ZK三萜含量高且三萜酸含量及成分豐富，但多糖含量較低，

8、適合推廣栽培；菌株SL9的靈芝酸A含量較高，多糖含量居中；菌株yx和SL4的多糖和三萜含量均較高，可進(jìn)行開發(fā)利用。
　　6比較相同菌株的野生采集和人工栽培子實體有效成分含量，野生子實體多糖和三萜含量分別為栽培子實體含量的87％以內(nèi)和75%左右，而且野生子實體的安全存在不穩(wěn)定性，表明栽培靈芝子實體更適合服用。
　　7通過搖瓶培養(yǎng)，得到G. multipileum-Y1的生物量最高，為1.226 g/100mL；發(fā)酵液多糖結(jié)果顯

9、示G. multipileum-Y1和G. sp-YX的含量較高；菌絲三萜以G.multipileum的菌株LJ和Y1及G. sp-ZJ的較高，其中G. multipileum-LJ最高，為15.72 mg/g。結(jié)合以上研究得出：G. multipileum-Y1生長速度快，菌絲生物量高，菌絲三萜和發(fā)酵液多糖含量都很高，適合作為液體深層發(fā)酵菌株。另外HPLC圖譜表明，因菌絲的三萜酸含量極低，無法對不同菌種進(jìn)行區(qū)別分類。赤芝菌株中SL4的