柑橘黑斑病、褐斑病的分離鑒定及分子檢測.pdf

1、柑橘是世界上最重要的果樹種類之一,其產(chǎn)量位居水果之首,具有重要的經(jīng)濟地位。分別由柑橘球座菌(GuignardiacitricarpaKiely)和交鏈格孢菌[Alternariaalternata(Fr.)Keissle]引起的柑橘黑斑病和柑橘褐斑病是引起柑橘果實病變的重要病害,主要在柑橘果實上形成黑色或褐色病斑,嚴重時病斑布滿整個果面,導致果實脫落,造成大量減產(chǎn)。
　　 本研究對從四川、廣西、福建、重慶、巴西等地采集柑橘黑斑病

2、和柑橘褐斑病疑似樣品進行分離鑒定,并對獲得的陽性樣品進行序列分析,結果發(fā)現(xiàn):
　　 1、從48個柑橘黑斑病疑似樣品中分離得到14株柑橘黑斑病菌株。
　　 (1)根據(jù)菌落在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)特征,將分離得到的菌落歸為四類。采用分生孢子懸浮液進行接種試驗,只有瑁溪蜜柚在接種兩個月后表現(xiàn)出癥狀。對接種后的植株進行PCR檢測,結果表明只有在琯溪蜜柚上檢測出柑橘黑斑病菌的存在。
　　 (2)以核糖體DNA內(nèi)轉錄間隔區(qū)(r

3、DNA-ITS)為靶標采用真菌通用引物ITS1/ITS4進行PCR擴增,得到610bp大小的片段,其靈敏度為0.1ng。經(jīng)BLAST比對后,與柑橘黑斑病的同源性達99%,由此明確分離得到的菌株為柑橘黑斑病菌。將獲得的14株菌株的rDNA-ITS序列構建進化樹,發(fā)現(xiàn)柑橘黑斑病菌的種內(nèi)遺傳多樣性較為豐富
　　 (3)對柑橘上常見的真菌性病害柑橘脂點黃斑病、柑橘炭疽病、柑橘黑斑病的ITS序列進行多重同源性比較,設計了柑橘黑斑病的特異性

4、引物RT-1/RT-2,其靶標帶為210bp。利用L9(34)正交法優(yōu)化了PCR反應參數(shù)。用梯度PCR優(yōu)化退火溫度,明確最佳退火溫度為54.7℃。該特異性引物RT-1/RT-2的靈敏度為0.1pg。該檢測體系為柑橘黑斑病的檢測提供了一種快速、方便、靈敏的檢測手段,為柑橘黑斑病的防控提供了基礎。
　　 2、從8個柑橘褐斑病樣品分離得到4株柑橘褐斑病菌株
　　 分離得到的病菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落灰色,氣生菌絲發(fā)達,分隔,多