牡丹紅斑病及牡丹黑斑病病原鑒定.pdf

1、牡丹紅斑病和牡丹黑斑病均為牡丹種植區(qū)危害最嚴(yán)重的病害，它們不僅危害牡丹的葉片，還對(duì)花、種子、莖等造成嚴(yán)重危害，使牡丹葉片產(chǎn)生病斑、穿孔，嚴(yán)重者甚至引起整個(gè)植株死亡，嚴(yán)重影響牡丹生長(zhǎng)發(fā)育，降低了牡丹的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)牡丹病害研究較少，對(duì)牡丹紅斑病的鑒定一直停留在形態(tài)學(xué)鑒定的水平上，而對(duì)牡丹黑斑病的研究只有簡(jiǎn)單的病征記錄和防治研究，對(duì)致病菌只是模糊地描述為鏈格孢屬（Alternaria）真菌，尚無(wú)明確結(jié)論。本研究結(jié)合傳統(tǒng)

2、的形態(tài)學(xué)鑒定和致病性鑒定，在分子水平上對(duì)牡丹紅斑病和黑斑病病原菌進(jìn)行鑒定，以期明確上述兩種病害的確切病原菌，提供快速、準(zhǔn)確的鑒定方法，為病害快速診斷和防治措施提供技術(shù)支持。
　　1.形態(tài)學(xué)鑒定牡丹病斑病原菌為牡丹枝孢霉
　　從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)牡丹種質(zhì)資源圃采集不同品種的牡丹、芍藥紅斑病的發(fā)病葉片樣品，利用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)得到病原菌純菌落，保存利用。在顯微鏡下對(duì)病原菌的菌絲體和分生孢子進(jìn)行拍照觀

3、察，將從22個(gè)不同品種寄主上得到的菌株的分生孢子隨機(jī)取50個(gè)樣測(cè)量其分生孢子長(zhǎng)和寬，計(jì)算平均值，得其長(zhǎng)在9.4μm-9.8μm之間，孢子寬在4.5μm-4.9μm之間,結(jié)果表明不同寄主間沒(méi)有明顯差異，且與魏景超對(duì)牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae）的描述相一致。
　　2.分子鑒定牡丹紅斑病病原菌為牡丹枝孢霉
　　利用CTAB法對(duì)不同寄主上得到的分離物進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，送由專(zhuān)業(yè)公司對(duì)菌株的I

4、TS區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在Genbank中進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)其與已經(jīng)提交的牡丹枝孢霉Genbank中登錄的序列號(hào)為GQ395812的ITS序列相似性系數(shù)為99％以上。將從牡丹品種‘丁香紫’、‘趙粉’和芍藥品種‘大葉粉’、‘桃李艷’上分離獲得的菌株的ITS核苷酸序列，在Genbank中注冊(cè)獲得的登錄號(hào)為KJ638030、KJ682319、KJ682320、KJ682321。利用Mega5軟件將4個(gè)菌株的ITS區(qū)序列和Genb

5、ank中下載的已知登錄號(hào)的Cladosporium屬的24個(gè)菌株進(jìn)行BLAST序列分析，構(gòu)建聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖，可將枝孢霉屬分為4個(gè)聚類(lèi)組，4個(gè)樣品菌株KJ638030、KJ682319、KJ682320、KJ682321與牡丹枝孢霉的同源性最高，達(dá)到99％以上，聚為一組。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、致病性鑒定可以鑒定該病的致病菌為牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae）。四個(gè)菌株分別從不同寄主品種上分離獲得，說(shuō)明泰安地區(qū)牡丹枝孢霉沒(méi)有

6、遺傳差異，且不同種、品種的寄主對(duì)菌株的遺傳特性不造成影響。
　　3.牡丹紅斑病病原菌致病性鑒定
　　采用菌絲塊針刺接種和菌絲塊無(wú)傷口接種兩種方法，在實(shí)驗(yàn)室將分離物接種到牡丹葉片上，寄主牡丹品種為‘綠繡球’、‘豆綠’、‘紅珠女’、‘玉版白’、‘黑海撒金五個(gè)品種。觀察發(fā)現(xiàn)，采用同種接種方法接種的5個(gè)品種的牡丹葉片的發(fā)病率和感病特征沒(méi)有差異。將接種后發(fā)病病斑重新進(jìn)行組織分離，得到的病原菌與接種菌一致，證明該菌為牡丹紅斑病的致病菌。

7、同時(shí)，兩種接種方法比對(duì)可發(fā)現(xiàn)，刺傷接種的葉片發(fā)病早，無(wú)傷接種的葉片發(fā)病晚，且擴(kuò)展速度明顯比刺傷接種的葉片慢，但對(duì)照組的牡丹品種均不出現(xiàn)感病癥狀。說(shuō)明在室內(nèi)接種條件下，牡丹紅斑病病原菌的致病性與寄主品種無(wú)關(guān)，傷口的存在有利于病原菌的侵入可加快侵染速度，但是在自然無(wú)傷的條件下，病原菌也可對(duì)寄主進(jìn)行侵害。
　　4.鑒定牡丹黑斑病病原菌為Alternaria alternata
　　通過(guò)對(duì)泰安地區(qū)的牡丹病葉進(jìn)行組織分離，利用形態(tài)學(xué)方

8、法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并利用Mega5軟件對(duì)鏈格孢屬的22個(gè)種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，進(jìn)一步明確其分類(lèi)地位。結(jié)果表明:該病致病菌的ITS序列與GenBank中登錄的A.alternata、A.tenuissima、A.metachromatica相似性均為100％，利用DNAMAN軟件對(duì)核苷酸一致性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)樣品菌株與A.alternata相似性最高，結(jié)合形態(tài)學(xué)方法鑒定該病致病菌為Alternaria alternata