大鼠LEAP-2基因克隆與小型發(fā)酵高效表達.pdf

1、目的：本論文以大鼠為實驗材料，探討了LEAP-2在正常大鼠肝臟、大腸、小腸、脾、心臟、腦、腎、胃、肌肉、以及感染大鼠的肝臟等組織材料中的mRNA表達情況并對其中表達豐度量高的肝臟LEAP-2進行了克隆及酵母表達，對真核酵母表達進行了小型發(fā)酵工藝流程方向的探索。 方法取正常大鼠肝臟、大腸、小腸、脾、心臟、腦、腎、胃、肌肉、以及感染大鼠的肝臟等組織材料，提取總RNA，借助于G3PDH持家基因進行相對定量，對上述10種組織材料種的L

2、EAP-2mRNA的表達豐度進行了研究；取正常肝臟組織材料，提取總RNA后進行RT-PCR、克隆、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆并舉行序列測定，應(yīng)用生物信息學(xué)對測序結(jié)果進行虛擬化分析和同源性比較；經(jīng)酶切、轉(zhuǎn)化，將LEAP-2基因定向克隆于真核巴斯德畢赤酵母表達載體PA0815，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達得到表達產(chǎn)物；應(yīng)用小型發(fā)酵罐對LEAP-2進行工藝流程優(yōu)化。 結(jié)果大鼠LEAP-2的表達豐度從高到低依次為：感染大鼠的肝臟、肝臟、小腸、脾、心臟、大腸

3、、腦、腎、胃、肌肉；克隆了LEAP-2基因全長，獲基因登錄號：DQ066720；構(gòu)建了LEAP-2真核巴斯德畢赤酵母表達載體pPIC9/LEAP-2，并成功的進行了甲醇誘導(dǎo)表達，與原核系統(tǒng)表達不同的是，該系統(tǒng)直接表達產(chǎn)物到培養(yǎng)液種，為大量純化奠定了基礎(chǔ)；對LEAP-2基因進行了小型發(fā)酵，并對其中一些具體工藝進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)1％甲醇、pH6.0、48h是最佳發(fā)酵條件 結(jié)論大鼠各種組織當中，肝臟LEAP-2表達豐度最高；生物信息學(xué)