Klotho對衰老間質(zhì)細胞和結直腸癌細胞CCL--2分泌的抑制作用及其機制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)報道全球每年CRC新發(fā)病例高達136萬，死亡病例約達69萬，嚴重危害人類健康。尋找結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵分子及其相互關系，進一步闡明結直腸癌的發(fā)病機制具有重要的意義。
　　結直腸癌發(fā)病隨著年齡的增長，發(fā)病風險增加。近年研究發(fā)現(xiàn)細胞衰老可能影響周圍微環(huán)境促進腫瘤的發(fā)生。該微環(huán)境是由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、免疫細胞和腫瘤

2、周圍的細胞外基質(zhì)等共同構成的復雜網(wǎng)絡。
　　Klotho是由Kuro-o等在1997年發(fā)現(xiàn)的一種衰老相關多功能蛋白，其在生物整體抗衰老和延長壽命方面的作用廣受關注。Klotho基因表達下降與壽命縮短、動脈硬化、心腦血管等疾病的發(fā)生相關。近年來人們發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤組織中也存在Klotho低表達現(xiàn)象，提示Klotho基因可能參與腫瘤調(diào)控。我們前期利用基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)Klotho基因受到表觀遺傳調(diào)控，在結腸癌細胞中低表達與啟動子DNA高

3、甲基化有關。本研究將進一步闡明Klotho在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的臨床價值和重要生物學功能，探討Klotho對間質(zhì)細胞衰老和衰老相關分泌表型的表達調(diào)控和作用機制。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　1、Klotho在結直腸癌組織中的表達及意義:
　　通過收集143例結直腸癌患者的組織標本，分析Klotho在結直腸癌和癌旁組織中的蛋白表達水平差異及其與患者臨床病理參數(shù)和生存預后之間的相關性，明確Klotho在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的臨

4、床意義。
　　2、Klotho對細胞衰老和結腸癌細胞生物學行為的影響:
　　應用重組Klotho蛋白處理不同間質(zhì)細胞（成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞），檢測SA-β-gal染色及衰老標志分子，觀察Klotho對細胞衰老的影響。通過系列體內(nèi)外試驗，利用Klotho預處理不同間質(zhì)細胞后，收集條件培養(yǎng)基與結腸癌細胞共培養(yǎng);或在結腸癌細胞中過表達Klotho，探討Klotho對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲及其裸鼠成瘤能力的影響。
　　

5、3、Klotho對衰老相關分泌表型CCL-2表達的影響與生物學作用:
　　通過建立批量衰老相關分泌表型分子篩選和驗證。利用細胞體外和動物體內(nèi)實驗探索關鍵衰老相關分泌表型因子CCL-2對結腸癌細胞生物學行為的影響。
　　4、Klotho通過NF-κB信號通路抑制CCL-2分泌:
　　在間質(zhì)細胞中，應用重組Klotho蛋白或NF-κB特異性拮抗劑處理，或在結腸癌細胞中過表達Klotho，通過免疫印跡法檢測NF-κB信號通路

6、中相關分子的表達變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測CCL-2的分泌情況，探討Klotho對NF-κB和CCL-2的調(diào)控機制。
　　研究結果：
　　1、Klotho在結直腸癌組織中低表達并與患者預后差相關
　　免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，較癌旁配對非腫瘤組織，Klotho在結直腸癌組織中表達明顯降低，其表達水平與患者年齡、淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關（n=143，P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組

7、織中Klotho高表達的患者預后較好。多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)Klotho高表達是患者生存時間長的獨立預測因子（P＜0.05）。
　　2、Klotho抑制間質(zhì)細胞衰老和結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲
　　(1)Klotho對間質(zhì)細胞衰老的影響。SA-β-gal染色及衰老標志分子的檢測發(fā)現(xiàn)人重組Klotho蛋白預處理間質(zhì)細胞，可以減少細胞衰老。
　　(2)Klotho通過抑制間質(zhì)細胞衰老對結腸癌細胞生物學行為的影響
　

8、　①CCK-8細胞增殖實驗和克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞經(jīng)過衰老細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后，其生長速度明顯加快，而外源Klotho預處理則明顯抑制結腸癌細胞生長。
　?、赥ranswell試驗表明結腸癌細胞經(jīng)過衰老細胞的條件培養(yǎng)基趨化后，其遷移和侵襲能力顯著增強，而外源Klotho預處理可減弱結腸癌細胞遷移和侵襲能力。
　?、劢Y腸癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞與衰老細胞混合注射組裸鼠腫瘤體積和重量明顯大于年輕細胞組，而Klot

9、ho預處理組裸鼠腫瘤的體積和重量最小。
　　(3)過表達Klotho抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲
　?、貱CK-8細胞增殖實驗，發(fā)現(xiàn)過表達Klotho顯著抑制結腸癌細胞的增殖。
　　②Transwell試驗表明過表達Klotho能夠顯著抑制結腸癌細胞的遷移、侵襲能力。
　?、劢Y腸癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)過表達Klotho后裸鼠瘤體的生長較對照組明顯減慢。
　　3、Klotho可抑制SASP分子CCL-2的表

10、達及其促結腸癌生長、遷移、侵襲作用
　　(1)間質(zhì)細胞誘導衰老后，CCL-2的mRNA表達和蛋白的分泌明顯升高，而Klotho蛋白的預處理則顯著下調(diào)CCL-2。
　　(2)CCL-2具有促進結腸癌細胞增殖、遷移作用
　　①CCK-8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)CCL-2蛋白共培養(yǎng)可促進結腸癌細胞增殖，特異性受體CCR2拮抗劑可阻斷該作用。
　?、赥ranswell試驗表明CCL-2顯著促進結腸癌細胞的遷移能力，而特異性受體C

11、CR2拮抗劑可阻斷該作用。
　　③結腸癌皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)瘤周注射CCL-2分子后裸鼠瘤體的生長較對照組明顯增快，而同時注射CCR2特異性拮抗劑后可抑制腫瘤生長。
　　4、Klotho通過NF-κB信號通路抑制CCL-2分泌
　　(1)衰老成纖維細胞中NF-κB信號通路活化，人重組Klotho蛋白和NF-κB特異性拮抗劑可以抑制其活化。
　　(2)熒光定量PCR和ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)NF-κB特異性拮抗劑或Kl

12、otho處理后，細胞CCL-2的mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào)。
　　(3)在結腸癌細胞中過表達Klotho后NF-κB信號通路被抑制，CCL-2的mRNA表達及蛋白分泌明顯減少。
　　研究結論：
　　1、在結直腸癌組織中Klotho普遍低表達，其表達水平與患者的年齡，腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和患者的生存預后相關。Klotho高表達是結直腸癌患者生存預后良好的一個獨立預測因素。
　　2、Klotho可