基于表面等離子共振技術(shù)的活性蛋白濃度絕對(duì)定量方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)有著多樣而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，是生命體的重要組成部分，具有多種多樣的生物學(xué)功能，廣泛參與到人的生命活動(dòng)中，這引起了藥物開(kāi)發(fā)和臨床診斷等行業(yè)強(qiáng)烈的關(guān)注。蛋白的活性濃度數(shù)據(jù)是理解蛋白質(zhì)相互作用所需的最重要的數(shù)據(jù)，現(xiàn)階段缺乏可追溯到國(guó)際單位（SI單位）的測(cè)量活性蛋白的基本分析方法，這意味著目前沒(méi)有用于活性蛋白的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法建立活性蛋白的溯源鏈。這已經(jīng)成為藥物開(kāi)發(fā)和臨床診斷等發(fā)展的障礙，并導(dǎo)致基于蛋白活性的測(cè)量的問(wèn)題，例如免疫測(cè)定中的互通性問(wèn)題

2、。
　　本文基于對(duì)人體健康的關(guān)注，從轉(zhuǎn)基因作物和疾病診斷兩個(gè)方面入手，選取了植物源G2-EPSPS轉(zhuǎn)基因蛋白和人心肌紅蛋白(hMYO)兩個(gè)目標(biāo)物進(jìn)行了研究，提出了基于表面等離子共振技術(shù)(SPR)的無(wú)標(biāo)定量法（Calibration-free Concentration Analysis（CFCA法）），初步建立起可追溯到SI單位的活性靶標(biāo)蛋白絕對(duì)定量方法。
　　首先用CFCA法對(duì)G2-EPSPS和hMYO的活性濃度進(jìn)行絕對(duì)定

3、量，包括對(duì)蛋白樣品的純度、分子量和擴(kuò)散系數(shù)等信息進(jìn)行了鑒定，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的條件，如抗體偶聯(lián)溶液的pH、再生試劑和偶聯(lián)密度等進(jìn)行篩選和優(yōu)化，在最優(yōu)條件下對(duì)G2-EPSPS蛋白和hMYO進(jìn)行活性濃度的絕對(duì)定量，得到的活性濃度分別為2778.6nM和62733.9nM。對(duì)所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)考察，日內(nèi)精密度分別為3.26％～4.59％和2.50％～4.23％，日間精度分別為8.36％和3.12％，具有良好的的重復(fù)性、再現(xiàn)性。然后用同位素稀釋

4、質(zhì)譜法（IDMS法）對(duì)G2-EPSPS和hMYO準(zhǔn)確測(cè)定其總蛋白濃度，與各自的活性濃度相比，活性蛋白分別占總蛋白的17.89％和43.03％。最后在準(zhǔn)確的活性蛋白濃度基礎(chǔ)上，對(duì)G2-EPSPS和hMYO和他們對(duì)應(yīng)的抗體之間的相互作用進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)研究，得到更可靠的結(jié)合常數(shù)ka、解離常數(shù)kd、親和力常數(shù)kD，分別為2.18×106M-1s-1、5.79×10-3s-1、2.65×10-9M和2.58×106M-1s-1、2.30×10-3s