超聲場(chǎng)影響大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的研究.pdf

1、超聲新技術(shù)的出現(xiàn)引起了人們的濃厚興趣，已廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別在對(duì)細(xì)胞膜的影響方面成為研究熱點(diǎn)。提高膜通透性在獲取胞內(nèi)產(chǎn)物或使胞外大分子進(jìn)入胞內(nèi)方面有重要的應(yīng)用意義。傳統(tǒng)用于提高細(xì)胞膜通透性的是化學(xué)法具有處理時(shí)間長(zhǎng)、效率低、試劑用量大、成本高、后處理麻煩等缺點(diǎn)。本論文以基因工程上常用的大腸桿菌為研究對(duì)象，研究了不同超聲參數(shù)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響。在此基礎(chǔ)上，對(duì)超聲作用參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇合理的超聲條件，確定超聲提高大腸桿菌細(xì)胞膜

2、通透性的最適工藝條件。進(jìn)而與化學(xué)方法進(jìn)行比較。研究中應(yīng)用熒光探針?lè)疾旒?xì)胞膜通透性、膜電壓，胞內(nèi)活性氧(ROS)、游離鈣(Ca2+)的變化并且利用掃描電鏡、透射電鏡觀察，從微觀角度分析超聲場(chǎng)提高大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的機(jī)理。建立超聲作用大腸桿菌細(xì)胞膜變化的動(dòng)力學(xué)模型。研究表明： 變幅桿浸入式超聲的功率、作用時(shí)間、間隙時(shí)間(頻率為25kHz)對(duì)大腸桿菌膜的通透性及生存率均有影響。對(duì)這三個(gè)參數(shù)進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果顯示，超

3、聲的電功率、作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌生存率的影響極顯著，間隙時(shí)間對(duì)大腸桿生存率的影響不顯著；超聲波的電功率、作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌的細(xì)胞膜通透性影響極顯著，間隙時(shí)間對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響顯著。影響大腸桿菌細(xì)胞膜通透性大小先后次序?yàn)椋鹤饔脮r(shí)間＞電功率＞間隙時(shí)間。優(yōu)化提高大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的最佳作用參數(shù)為：作用電功率為300W、作用時(shí)間為90s、間隙時(shí)間為4s。 化學(xué)方法與超聲方法比較。實(shí)驗(yàn)表明：化學(xué)方法可以提高細(xì)胞膜的通透性，但是

4、對(duì)細(xì)胞活性的影響很大，經(jīng)過(guò)處理后的大腸桿菌的存活率很低。該方法提高細(xì)胞膜通透性時(shí)用的化學(xué)試劑消耗量大、費(fèi)用高，試劑殘留造成環(huán)境污染，而且后處理過(guò)程復(fù)雜，不易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化。適當(dāng)超聲處理不僅可以提高細(xì)胞膜對(duì)代謝產(chǎn)物的通透性，使細(xì)胞仍保持一定的活性，而且操作參數(shù)易控制、目標(biāo)產(chǎn)物易分離、無(wú)殘余毒性、與環(huán)境友好、高效、價(jià)廉、無(wú)污染、適用性強(qiáng)、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、連續(xù)化、具有極大的應(yīng)用潛力，顯示出超聲方法的優(yōu)越性。 利用熒光探針FDA檢測(cè)來(lái)

5、反映細(xì)胞膜通透性的變化。FDA負(fù)載入大腸桿菌后發(fā)出黃綠色熒光，說(shuō)明利用FDA熒光探針染色法標(biāo)記可行。結(jié)果顯示：在25kHz、300W、90s內(nèi)，熒光強(qiáng)度漸漸降低，90s時(shí)下降到66.7﹪，即細(xì)胞膜通透性增加33.3﹪，此時(shí)細(xì)胞生存率為79.4﹪，再隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)DA明顯下降，是由于細(xì)胞生存率明顯下降引起。 利用熒光探針DiBAC4(3)檢測(cè)來(lái)反映細(xì)胞膜電壓的變化。DiBAC4(3)載入大腸桿菌后發(fā)出亮綠熒光，利用DiBAC

6、4(3)熒光探針染色法標(biāo)記可行。結(jié)果顯示：在25kHz、300W、30s-90s內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸下降，90s時(shí)降為73.2﹪，即膜電壓下降26.8﹪，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)DiBAC4(3)明顯降低。在90s時(shí)細(xì)胞的存活率為79.4﹪。超聲作用90s內(nèi)后膜電壓下降，胞內(nèi)外離子濃度差加大，促進(jìn)了分子交換速度。超聲波場(chǎng)引起的細(xì)胞膜電壓比較大，使得Ca2+內(nèi)流量較大時(shí)，K+大量外流占優(yōu)勢(shì)，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞膜電壓進(jìn)一步超極化，膜電壓探針熒光下降。導(dǎo)致膜電壓依

7、賴的Ca2+、Na+以及大分子物質(zhì)離子通道都打開(kāi)，膜兩側(cè)離子交流加速，即膜的通透性增加。 利用熒光探針DCFH-DA法檢測(cè)來(lái)反映胞內(nèi)活性氧的變化。大腸桿菌經(jīng)DCFH-DA負(fù)載發(fā)出綠色熒光，DCFH-DA熒光探針染色法標(biāo)記可行。結(jié)果顯示：經(jīng)25kHz、300W，30-90S超聲作用后DCFH-DA增加，說(shuō)明一定超聲作用后大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平提高。在超聲作用的空化效應(yīng)特別易產(chǎn)生活性氧(包括自由基)，使脂雙分子層過(guò)氧化而有破壞膜

8、結(jié)構(gòu)。膜變脆易穿孔，流動(dòng)性也變差。ROS水平上升導(dǎo)致ROS依賴性的鈣離子通道打開(kāi)，進(jìn)而鈣離子依賴性的其它(K+，Na+等)通道也打開(kāi)，膜兩側(cè)物質(zhì)交流加速，即膜通透性增加。 利用熒光探針Fura-2/AM法檢測(cè)來(lái)反映胞內(nèi)鈣離子的變化。大腸桿菌經(jīng)Fura-2/AM負(fù)載后發(fā)出亮藍(lán)色熒光，F(xiàn)ura-2/AM熒光探針染色法標(biāo)記可行。結(jié)果顯示：經(jīng)25kHz、300W，30-60S超聲作用后Fura-2/AM熒光強(qiáng)度增加，說(shuō)明一定超聲作用后

9、大腸桿菌經(jīng)胞內(nèi)鈣離子水平提高。ROS水平增加，在信號(hào)傳導(dǎo)中可導(dǎo)致鈣高子通道打開(kāi)，離子內(nèi)流，胞內(nèi)鈣濃度增加，實(shí)驗(yàn)證實(shí)胞內(nèi)鈣離子濃度是增加了，即膜通透性增加。 掃描電鏡、透射電鏡觀察顯示：未經(jīng)超聲處理的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核、表面光滑，細(xì)胞膜清晰，膜沒(méi)有變化，沒(méi)有損傷。經(jīng)25kHz、300W、30s超聲處理后細(xì)胞形態(tài)特征表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜形態(tài)開(kāi)始改變，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整。經(jīng)25kHz、300W、60s超聲處理后細(xì)胞膜完整脂雙分

10、子層開(kāi)始變模糊，經(jīng)25kHz、300W、90s顯示表面有小孔的地方，內(nèi)容物向外滲透。經(jīng)300W、150s細(xì)胞膜受嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)外滲，細(xì)胞開(kāi)始自溶。經(jīng)25kHz、300W、270s顯示隨超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞核破裂，細(xì)胞膜破壞，細(xì)胞變成碎片。在一定超聲作用下大腸桿菌膜通透性改變和膜穿孔。超聲空化產(chǎn)生自由基使膜脂過(guò)氧化，因而對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用，使膜結(jié)構(gòu)破壞、崩解而影響其通透性。超聲作后細(xì)胞膜的電特性(電壓、電導(dǎo)和膜電容等)、機(jī)械特性(膜的損

11、傷或修復(fù)等)和分子運(yùn)輸能力(透過(guò)膜的微粒數(shù)量等)產(chǎn)生變化，使細(xì)胞膜穿孔而影響其通透性。 運(yùn)用傳遞理論以及質(zhì)量守恒原理，建立了超聲作用大腸桿菌膜變化的動(dòng)力學(xué)模型：E(t)=k3T-k1/k2+k3·e-(k2+k3)·t+k2T-k1/k2+k3 通過(guò)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果模擬表明，該模型對(duì)膜變化過(guò)程具有很好的預(yù)測(cè)功能，能反映膜變化的實(shí)際過(guò)程。 超聲在溶液中產(chǎn)生空化現(xiàn)象，超聲作用主要?dú)w結(jié)于超聲的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。促進(jìn)溶

12、質(zhì)的擴(kuò)散，提高了傳質(zhì)系數(shù)，增大了傳質(zhì)界面積，傳質(zhì)推動(dòng)力變大，從而在整體上對(duì)細(xì)胞膜通透性有增加效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與詳細(xì)的理論探討表明：超聲可提高細(xì)胞膜通透性，主動(dòng)力是超聲的空化效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)。電鏡觀察膜變化過(guò)程有脂雙分子層變形效應(yīng)、有‘穿孔’效應(yīng)。利用所建立的擬合方程推算出超聲作用提高膜的傳質(zhì)速率常數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)超聲提高膜通透性的機(jī)理。 本論文將新興的超聲技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對(duì)超聲影響大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的因素、作用