基于DHPLC技術(shù)的中國(guó)南方人群肝豆?fàn)詈俗冃缘耐蛔兎治?pdf

1、背景與目的:肝豆?fàn)詈俗冃杂址QWilson病(Wilson disease,WD)[MIM＃277900],是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝缺陷病,其基本代謝缺陷是肝臟不能正常合成銅藍(lán)蛋白和自膽汁中銅排出量減少,導(dǎo)致銅在體內(nèi)各臟器和組織中沉積(以腦和肝臟為主),從而引起一系列的臨床表現(xiàn)。肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床表現(xiàn)形式多樣,以進(jìn)行性肝臟損害、神經(jīng)精神系統(tǒng)功能障礙、角膜邊緣有銅鹽色素沉著環(huán)(Kayser-Fleischer ring,K-F環(huán))為主

2、。該病在全球的發(fā)病率大約為1/30000,攜帶者頻率為1/90；在中國(guó)該病的發(fā)病率高達(dá)1/10000,報(bào)道的病例數(shù)居國(guó)內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)單基因遺傳病的首位,占神經(jīng)遺傳門診的10.14％。肝豆?fàn)詈俗冃允悄壳吧贁?shù)幾個(gè)用藥物治療效果較好的單基因遺傳病之一,治療的重點(diǎn)在于早診斷、早治療。然而,由于肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叩呐R床表現(xiàn)形式多樣,且早期癥狀一般比較隱匿,而銅生化檢查結(jié)果在患者、雜合子和正常人之間存在10％～25％的重疊,這些因素常導(dǎo)致疾病的延誤診斷。

3、因此,對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?尤其是一些臨床表現(xiàn)不典型的病例進(jìn)行基因診斷,對(duì)提高患者的生活質(zhì)量具有重要意義。
　　 作為肝豆?fàn)詈俗冃晕ㄒ坏闹虏』?ATP7B基因于1993年定位并克隆于13q14.3,其cDNA編碼一種由1465個(gè)氨基酸殘基組成的P型銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶(即ATP7B)。ATP7B蛋白主要有三個(gè)功能區(qū),包括6個(gè)銅離子結(jié)合區(qū)、P型ATP酶功能區(qū)和8個(gè)跨膜功能區(qū)。肝豆?fàn)詈俗冃曰颊叩耐蛔冃问蕉鄻?以復(fù)合雜合突變?yōu)橹?只有少數(shù)純

4、合突變；以少數(shù)幾個(gè)常見突變?yōu)橹?伴有廣泛的罕見突變。到目前為止,世界范圍內(nèi)報(bào)道的致病突變已經(jīng)超過500種,其中100余種在中國(guó)人群中報(bào)道,這些突變主要累及ATPTB基因的P型ATP酶功能區(qū)。此外,ATP7B等位基因突變具有極大的遺傳異質(zhì)性,即不同國(guó)家、民族或地區(qū)的熱點(diǎn)突變區(qū)和高頻突變位點(diǎn)不同,如在歐美裔WD患者中,14號(hào)外顯子的p.His1069Gln突變和18號(hào)外顯子的p.Gly1266Lys突變最為常見；中國(guó)人8號(hào)外顯子的p.Arg

5、778Leu突變發(fā)生率最高,是亞洲WD患者的優(yōu)勢(shì)突變。因此,建立不同地區(qū)、不同民族的肝豆?fàn)詈俗冃酝蛔冏V,有利于對(duì)肝豆患者尤其是一些癥狀前患者進(jìn)行快速診斷。
　　 近年來發(fā)展起來的變性高效液相色譜(Denaturing high-performance liquidchromatography,DHPLC)技術(shù)已被證明是一種具有準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量、半自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)的用于檢測(cè)已知突變和篩查未知突變的方法。DHPLC檢測(cè)基因突變的

6、原理是基于部分變性條件下,異源雙鏈和同源雙鏈在DNA解鏈特征上的差異,使得它們?cè)谏V柱中保留的時(shí)間不同而得以區(qū)分。與以往的變異檢測(cè)技術(shù),如變性梯度凝膠電泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)、錯(cuò)配化學(xué)切割分析(Chemical Cleavage of Mismatch,CCM)、構(gòu)象敏感性凝膠電泳(Conformation Sensitive Gel Electrophoresis,

7、CSGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single-Strand Conformation Polymorphisms,SSCP)等相比,DHPLC具有較高的敏感性和特異性,目前己廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的突變篩查和分子診斷?；贒HPLC上述特點(diǎn),本研究擬應(yīng)用PCR/DHPLC技術(shù)結(jié)合DNA直接測(cè)序,對(duì)中國(guó)南方人群肝豆?fàn)詈俗冃曰颊哌M(jìn)行突變分析,建立我國(guó)南方人群肝豆?fàn)詈俗冃缘耐蛔冏V,從而為中國(guó)南方肝豆患者的遺傳咨詢、臨床/產(chǎn)前診斷提供有用的信息。

8、
　　 材料與方法:收集了來自于70個(gè)無親戚關(guān)系家庭的73例臨床診斷為肝豆?fàn)詈俗冃缘幕颊呒捌浼覍贅颖竟?69例,均為我國(guó)南方地區(qū)漢族人群。肝豆?fàn)詈俗冃缘呐R床診斷依據(jù)包括以下2個(gè)方面:
　　 ①典型的臨床表現(xiàn):角膜色素沉著環(huán)(K-F環(huán)),急性或慢性肝臟損害,和/或震顫、肌僵直、構(gòu)語障礙等錐體外系癥狀、體征；
　　 ②常規(guī)的銅生化檢查:血漿銅藍(lán)蛋白水平降低(<0.2 g/L),24小時(shí)尿銅排泄增加(>100μg/24

9、h)。73例患者的發(fā)病年齡為3～48歲,其中男性41例(56.16％),女性32例(43.84％)；以肝型為主要表現(xiàn)的患者有45例,以腦型為主要表現(xiàn)的患者27例,還有1例表現(xiàn)為混合型。此外,用來自于本實(shí)驗(yàn)室的200例中國(guó)漢族正常人樣本作為對(duì)照研究。采用經(jīng)典的酚/氯仿法提取所有樣品的外周血基因組DNA,利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增ATP7B基因全部編碼序列及與外顯子毗鄰的剪接區(qū)域,用DHPLC技術(shù)直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行篩選,出現(xiàn)異常峰的樣本經(jīng)DNA直

10、接測(cè)序驗(yàn)證變異位點(diǎn)。
　　 結(jié)果與討論:應(yīng)用DHPLC技術(shù),通過對(duì)來自于70個(gè)無親戚關(guān)系家庭的73例肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?共146條染色體)及其家屬的ATP7B基因全部外顯子進(jìn)行突變篩查,我們共發(fā)現(xiàn)了50種異常色譜峰形,DNA直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)這些異常峰形由38種致病突變和13種多態(tài)組成。DHPLC峰形具有較好的重復(fù)性,即在同一片段中,相同突變的不同樣本的色譜峰形極為相似。本研究建立的基于PCR/DHPLC技術(shù)的肝豆?fàn)詈俗冃晕粗蛔兒Y查的

11、分子診斷方法是一種快速、準(zhǔn)確、高效、半自動(dòng)化、高通量的突變檢測(cè)技術(shù),適用于遺傳病的臨床/產(chǎn)前診斷以及大規(guī)模的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的38種致病突變包括24種錯(cuò)義突變、3種剪接位點(diǎn)突變、5種無義突變以及6種移碼突變。這些突變主要分布在外顯子3、7、8、11、12、13和16。73例患者中,有31例檢出2個(gè)致病突變,2例檢出3個(gè)致病突變,36例患者僅檢出一個(gè)突變以及4例未檢出突變。總的染色體突變檢出率為69.86

12、％(102/146),其中位于外顯子8上的突變占總突變的38.46％(40/104),居本研究突變檢出率的第一位；外顯子16上的突變占總突變的19.23％(20/104),居第二位；外顯子13上的突變占總突變的12.50％(13/104),居第三位。這三個(gè)外顯子上的突變覆蓋了總突變的70.19％(73/104)。因此,在對(duì)中國(guó)南方肝豆?fàn)詈俗冃曰颊哌M(jìn)行分子診斷時(shí),我們建議首先對(duì)外顯子8、16和13進(jìn)行突變篩查。
　　 73例患者中

13、,我們僅發(fā)現(xiàn)了3例純合子和30例復(fù)合雜合子,這說明肝豆?fàn)詈俗冃曰颊咭詮?fù)合雜合突變?yōu)橹?；另外?6例患者僅篩出一個(gè)突變以及4例未檢出突變,這意味著存在一些未知突變位于ATP7B基因編碼序列外,如內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子、DNA序列其它調(diào)控區(qū)域等。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示了肝豆?fàn)詈俗冃跃哂袠O大的異質(zhì)性,我們無法通過患者的基因型有效的推測(cè)表型。此外,我們對(duì)2例攜帶三個(gè)致病突變的患者進(jìn)行了家系分析,結(jié)果顯示兩個(gè)先證者共有的兩個(gè)突變——c.3443T>C和c

14、.3426G>C,位于同一條染色體上,c.3426G>C對(duì)c.3443T>C具有順式調(diào)控作用。這種現(xiàn)象先前僅在中國(guó)香港人群中報(bào)道,因此我們推測(cè)這種順式調(diào)控機(jī)制是中國(guó)南方人群所特有的。
　　 本研究的第一突變熱點(diǎn)是位于8號(hào)外顯子的p.Arg778Leu突變,其等位基因檢出率為23.29％(34/146),這與其它關(guān)于中國(guó)人第一突變熱點(diǎn)的研究報(bào)道一致。此外,我們通過比較p.Arg778Leu純合子組和復(fù)合雜合子組的臨床資料(包括發(fā)病

15、年齡、血清銅水平和血漿銅藍(lán)蛋白水平)來研究該熱點(diǎn)突變對(duì)患者表型的影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示兩組患者發(fā)病年齡的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,純合子組的發(fā)病年齡高于復(fù)合雜合子組(P=0.002)。這些結(jié)果顯示p.Arg778Leu是一種溫和突變,然而由于研究例數(shù)較少,更深入的探討p.Arg778Leu突變對(duì)患者表型的影響有待于病例的積累以及蛋白表達(dá)功能的研究。本研究的第二突變熱點(diǎn)為p.Ile1148Thr,位于16號(hào)外顯子,其染色體檢出率為9.59％(14

16、/146)。歐美裔患者的第一突變熱點(diǎn)p.His1069Gln在本研究中未檢出。此外,我們還檢測(cè)出了13種多態(tài),包括2種新的同義突變——位于5號(hào)外顯子的c.1839C>T(p.Ile613Ile)突變和位于13號(hào)外顯子的c.2922G>A(p.Thr974Thr)突變。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,我們還鑒定了10種新的致病突變,包括6種錯(cuò)義突變(c.2120A>G、c.2564C>A、c.2620G>C、c.2761A>C、c.3236G

17、>T和c.3446G>A)、2種剪接位點(diǎn)突變(c.2121+3A>T和c.3244-2A>G)、1種無義突變(c.3682A>T)以及1種移碼突變(c.18751876insAATT)。在200例正常對(duì)照人群中沒有發(fā)現(xiàn)這些突變,證實(shí)這10種為致病突變,而非多態(tài)。另外,通過在PubMed上進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,以及在肝豆?fàn)詈俗冃酝蛔兙W(wǎng)站(http://www.wilsondjsease.med.ualberta.ca/database.asp)和

18、人類突變數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/validate.php)進(jìn)行查詢,我們發(fā)現(xiàn)這10種突變未曾報(bào)道,證實(shí)為新突變。這些新突變進(jìn)一步擴(kuò)展了中國(guó)人肝豆?fàn)詈俗冃缘耐蛔兎秶?豐富了世界范圍內(nèi)ATP7B基因的突變譜。
　　 總的來說,本研究為肝豆?fàn)詈俗冃越⒘艘环N快速準(zhǔn)確的分子診斷方法；通過對(duì)中國(guó)南方人群肝豆?fàn)詈俗冃曰颊哌M(jìn)行突變分析,建立了我國(guó)南方人群肝豆?fàn)詈俗冃缘耐蛔冏V。在已報(bào)道的突變基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)了