中國南方人群常染色體顯性遺傳夜發(fā)額葉癲癇的CHRNB2基因突變篩查.pdf

1、癲癇是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,發(fā)病率高達49‰～7‰,目前我國約有癲癇患者一千萬,其中2/3為兒童。反復(fù)的癲癇發(fā)作勢必引起致殘甚至危及生命。癲癇疾病分型有多種。常染色體顯性遺傳夜間發(fā)作性額葉癲癇(autosomal dominantnocturnal frontal lobe epilepsy,ADNFLE)是一種常染色體顯性單基因遺傳病,通常兒童期起病,癥狀持續(xù)至成人期,男女發(fā)病率相似。發(fā)作與睡眠關(guān)系密切,其臨床特征為夜發(fā)性、叢集性、

2、短暫性的運動性發(fā)作。ADNFLE在大多數(shù)已知家系的遺傳外顯率多為70-80％或更低,同時也可見于散發(fā)病例。散發(fā)患者和家系病例都有著相似的臨床和腦電圖特征。家族間、家族內(nèi)的臨床表現(xiàn)復(fù)雜性和嚴重性差異很大,從遺尿到猛烈的過度運動均有可能發(fā)生?；颊叩纳窠?jīng)系統(tǒng)體查及頭顱CT、MRI影像學(xué)檢查基本正常。ADNFLE的診斷主要依據(jù)臨床發(fā)作特點,輔助檢查常缺乏特異性指標,ADNFLE由于多為夜間發(fā)作不易覺察,易被臨床誤診或延誤治療,導(dǎo)致反復(fù)癲癇發(fā)作勢

3、必引起智殘、甚至危及生命。因此對ADNFLE病例深入研究具有現(xiàn)實意義。目前,尋找ADNFLE的致病基因,探討其發(fā)病機制,已成為神經(jīng)醫(yī)學(xué)界的一個研究熱點。
　　 ADNFLE是首個被發(fā)現(xiàn)有明確基因變異遺傳背景的特發(fā)性家族性部分性癲癇。近十余年的國外研究提示ADNFLE的發(fā)生與編碼煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)亞基的基因突變有關(guān),但存在一定的種族差異。目前已有三個nAChR的α4、β2、α2亞單位編碼基因(CHRNA4、CHRNB

4、4、CHRNA2)先后被鑒定。至此,nAChR的多個亞基基因與ADNFLE發(fā)病密切相關(guān)已是不爭的事實。CHRNB2基因是第二個被發(fā)現(xiàn)與ADNFLE相關(guān)的乙酰膽堿受體亞單位基因,CHRNB2基因的已知突變僅見于為數(shù)不多的不同種族家系病例,尚未在散發(fā)病例中報道發(fā)現(xiàn)。目前已在8個家系中發(fā)現(xiàn)5種錯義突變:V287L(意大利),V287M(蘇格蘭、西班牙),I312M(瑞士、韓國),L301V(土耳其),V308A(蘇格蘭、英格蘭)。以上5個已知

5、錯義突變(V287L、V287M、I312M、L301V、V308A).均位于CHRNB2第5外顯子,分別位于編碼受體疏水跨膜區(qū)TM2或TM3。電生理功能研究顯示突變受體對乙酰膽堿的敏感性增加,離子通道的脫敏延遲以及對受體的鈣依賴性下降,這些都可能觸發(fā)癲癇發(fā)作.
　　 在近十余年間,已超過一百個家族病例相繼被研究報道。然而,發(fā)現(xiàn)明確基因突變的ADNFLE家系僅占全部ADNFLE家系的10％。ADNFLE的臨床表型與基因表型關(guān)系仍

6、未明確,不同種族間相同臨床表型的ADNFLE患者存在遺傳異質(zhì)性。家族問、家族內(nèi)的臨床表現(xiàn)復(fù)雜性和嚴重程度差異很大,同一家族同一突變不同個體表型也千差萬別。臨床上還存在一些散發(fā)的夜間發(fā)作性額葉癲癇病例,其臨床、神經(jīng)電生理特征及預(yù)后與ADNFLE沒有明顯區(qū)別,唯缺乏家族性發(fā)病特征。盡管散發(fā)病例與家系病例被猜測或許有著相同的遺傳背景,但目前絕大部分已知nAChR基因突變僅存在于少數(shù)家系患者中,而在散發(fā)病例罕有發(fā)現(xiàn)。迄今散發(fā)病例先后有2例發(fā)現(xiàn)C

7、HRNA4基因突變,但尚未在CHRNB2和CHRNA2基因中發(fā)現(xiàn)明確變異。其中的1例攜帶CHRNA4的S256L為黎巴嫩血統(tǒng)散發(fā)患者,隨后被證實為家系病例。近年中國報道首例散發(fā)患者在CHRNA4發(fā)現(xiàn)一錯義突變R308H。然而,國內(nèi)鮮有ADNFLE家系報道,多為散發(fā)病例,正是由于缺乏特異性診斷指標,給診斷和鑒別診斷帶來較大困難,因此嚴重地威脅患兒的健康和生命安全。盡管目前已知本病為常染色體顯性遺傳,但人們對這種癲癇發(fā)作了解甚少,究其因為主

8、要為ADNFLE的發(fā)病機制尚未完全闡明。國內(nèi)對該病的報道研究還主要處于臨床水平,如臨床表現(xiàn)特征,腦電圖等輔助檢查的綜合分析等,對該病相關(guān)分子生物學(xué)研究仍較薄弱,缺乏大樣本ADNFLE基因篩查研究。我國ADNFLE人群是否與目前國外研究的遺傳背景一致值得進一步深入探討。
　　 前期我們收集了中國漢族人群的106個患者,包括74個散發(fā)病例以及來自8個非親緣性家族的32個家系患者,并已應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序方法進行了CHRNA4基因突

9、變篩查未能發(fā)現(xiàn)已知突變,本研究將重點選取CHRNB2基因進行突變篩查,進一步尋找中國人群ADNFLE的致病基因,探索ADNFLE患者CHRNB2基因多態(tài)性的特征,闡明中國人群ADNFLE發(fā)病的分子機制?？蔀锳DNFLE的發(fā)病機制和遺傳基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)和新靶點,建立起為患者家系提供遺傳咨詢和早期診斷或產(chǎn)前診斷的基因診斷方法體系,從而促進ADNFLE的早期防治；通過生物工程手段阻止或者修復(fù)突變所造成的危害,針對該種疾病中的熱點突變或易感基因

10、位點開發(fā)新型藥物,從而促進ADNFLE的有效治療。這對于有效地治療和控制ADNFLB發(fā)作,改善患兒生活質(zhì)量,提高人口素質(zhì)等具有深遠的意義。
　　 [對象和方法]
　　 1.對象:參照國際抗癲癇聯(lián)盟2001年癲癇和癲癇綜合征的分類診斷標準并結(jié)合臨床特點診斷,收集2006年1月～2008年12月期間我院門診或住院收治確診中國南方人群漢族ADNFLE患者共106例,包括8個家系中現(xiàn)存患者32人,散發(fā)病例74人。對照組納入本地健

11、康人群200例,均為漢族,各項檢查均未見異常。
　　 2.臨床資料收集:全部患者均完善視頻長程腦電圖、頭部MRI檢查,建立ADNFLE病人資料庫,制定和采用統(tǒng)一的調(diào)查表和方法,進行家系調(diào)查、資料收集和處理。
　　 3.CHRNB2基因突變篩查:
　　 (1)全部106例ADNFLE患者及200例健康對照人群均抽取200 μl外周靜脈血液,提取基因組DNA。
　　 (2)根據(jù)CHRNB2基因組標準序列,設(shè)計

12、擴增全部外顯子的PCR引物,全部病例標本采用PCR特異性擴增CHRNB2基因的1～6外顯子片段。
　　 (3)對PCR產(chǎn)物進行純化,采用ABI3730測序儀進行測序。應(yīng)用Vector NTI8.0分析軟件分析測序結(jié)果,并與GenBank中的標準序列進行比對,確定可能的突變位點后,擴增200例健康對照組的相應(yīng)基因片斷進行比對,確定新發(fā)現(xiàn)的突變點,除外基因的多態(tài)性。如確定為突變位點,則采用上述方法對先證者家族成員進行突變篩查。

13、>　　 [結(jié)果]
　　 1.本研究里共收集8個ADNFLE家系,總發(fā)病人數(shù)35例,男17例,女18例,男:女約為1:1；存活患者32例,包括先證者8例,平均發(fā)病年齡5.5±0.5歲,每個家系患者≧3,簡單分離分析表明該遺傳模式屬于常染色體顯性遺傳。散發(fā)病例共74例,男42例,女32例,男:女約為1.3:1,平均發(fā)病年齡12.7±0.8歲。所有患者臨床表現(xiàn)均符合夜間額葉癲癇診斷標準,腦電圖多發(fā)生在
　　 非快速眼動相(n

14、on-REM)的第二階段,異常腦電圖多為一側(cè)或雙側(cè)額區(qū)癇樣電活動或局限性慢波增多。大部分患者對卡馬西平、奧卡西平,丙戊酸鈉及托吡酯等抗癲癇藥治療效果良好。
　　 2.實驗組共106例患者全部順利完成CHRNB2基因突變篩查,結(jié)果顯示在所有家系患者和散發(fā)患者中均未發(fā)現(xiàn)迄今已報道的CHRNB2的5個熱點突變(V287L、V287M、1312M、L301V、V308A)。
　　 3.在一個散發(fā)病例中新發(fā)現(xiàn)CHRNB2基因的雜合

15、子同義突變H161H(c.483C>T),位于CHRNB2基因第5外顯子,并不引起所表達編碼區(qū)第161氨基酸變化(His)。該變異也在患者健康母親中證實存在,隨后的200例健康對照結(jié)果均顯示陰性。另一散發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)核苷酸多肽c.1407C>G也為雜合子變異,位于CHRNB2基因第6外顯子同樣未引起表達氨基酸改變(Val),然而在2/200例健康人亦同時存在。
　　 [結(jié)論]
　　 1.我們采用候選基因突變篩查的策略,對本

16、研究的106例患者(包括8個家系患者32例,散發(fā)患者74例)應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序方法,順利擴增了CHRNB2全部1～6外顯子序列,結(jié)果顯示未能發(fā)現(xiàn)至今已報道的基因突變。這提示CHRNB2很可能不是中國南方人群ADNFLE患者的主要致病基因,進一步證實ADNFLE具有明顯的遺傳異質(zhì)性。
　　 2.我們在兩個散發(fā)病例中各新發(fā)現(xiàn)一同義突變H161H(c.483C>T)和單核苷酸多肽c.1407C>G,以上兩種變異均未在國內(nèi)外報道。雜