The Role of Cholinergic Neurons in the Regulation of Newborn Neurons in Dentate Gyrus.pdf

1、背景：
　　上世紀(jì)90年代以前，研究人員普遍認(rèn)為在成年哺乳動(dòng)物腦中的神經(jīng)元不能再生。因此，人們認(rèn)為在人的一生中，任何由于其它因素（如：中風(fēng)、頭部創(chuàng)傷、氧化應(yīng)激、神經(jīng)退行性疾病、衰老等）導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡，都將導(dǎo)致其功能的永久喪失。然而，早在上世紀(jì)60年代，阿爾特曼（Altman）和其同事就質(zhì)疑了這一觀點(diǎn)的可靠性。他們報(bào)道，在成年大鼠正常腦組織的至少兩個(gè)區(qū)域（海馬顆粒下層（the subgranuarzone, SGZ）和側(cè)腦室下區(qū)（

2、the subventricularzone, SVZ））內(nèi)，新生神經(jīng)元能持續(xù)不斷地產(chǎn)生。之后，海馬顆粒下層的新生神經(jīng)元逐漸遷移到齒狀回的顆粒層內(nèi)，側(cè)腦室下區(qū)的新生神經(jīng)元?jiǎng)t遷移到嗅球。由于受出生后的哺乳動(dòng)物大腦中不存在神經(jīng)元再生這種觀點(diǎn)的影響，使得阿爾特曼和戴斯（Das）（1965）的發(fā)現(xiàn)三十多年后才被大家廣泛接受。
　　哺乳動(dòng)物的多能神經(jīng)干細(xì)胞位于SGZ和SVZ。這些干細(xì)胞首先不對(duì)稱地分裂為一個(gè)子代祖細(xì)胞和一個(gè)子代干細(xì)胞。然后前

3、者能再不對(duì)稱地分裂為可分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元的子代細(xì)胞，并且祖細(xì)胞保持有多次分裂的能力。對(duì)這些新生細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化的研究，常常涉及到外源性給予胸苷類似物或溴脫氧尿甙（Brdu）這些可標(biāo)記分裂細(xì)胞的物質(zhì)。成年哺乳動(dòng)物大腦中的神經(jīng)元再生過(guò)程常受到許多內(nèi)在和外在因素的強(qiáng)烈影響。局部微環(huán)境（“神經(jīng)源性壁龕”或“干細(xì)胞壁龕”）中的內(nèi)源性外在因素包括：神經(jīng)前體細(xì)胞、周邊成熟細(xì)胞、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞纖毛、細(xì)胞分泌物和神經(jīng)遞質(zhì)?，F(xiàn)在的研究認(rèn)為

4、在SGZ和SVZ的微環(huán)境中，而不是大腦其它區(qū)域，存在一些特定的調(diào)控新生神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育的因素。一項(xiàng)權(quán)威的研究表明在成年小鼠海馬中的星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)體外成年源性海馬祖細(xì)胞的神經(jīng)分化。
　　乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它是被人類最早發(fā)現(xiàn)，并在生物體內(nèi)參與很多重要功能的遞質(zhì)，如：調(diào)控學(xué)習(xí)與記憶、情緒和睡眠等。雖然膽堿能神經(jīng)元胞體只分布在大腦中一些特定的核團(tuán)和區(qū)域，但其軸突幾乎支配整個(gè)大腦組織。例

5、如，海馬中雖然幾乎沒有膽堿能神經(jīng)元胞體的分布，但其間卻遍布來(lái)自基底前腦的膽堿能神經(jīng)纖維。許多研究表明GABA能神經(jīng)元、谷氨酸能神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元對(duì)海馬齒狀回區(qū)的新生神經(jīng)元具有重要的調(diào)控作用，但作為重要神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿）來(lái)源的膽堿能神經(jīng)元卻鮮有報(bào)道。
　　目的：
　　本研究的目的主要包括三部分：
　　1.應(yīng)用轉(zhuǎn)基因和光遺傳手段特異性抑制或激活基底前腦膽堿能神經(jīng)元，觀察膽堿能神經(jīng)元對(duì)海馬齒狀回區(qū)新生神經(jīng)元的調(diào)控作用<

6、br>　　2.運(yùn)用電生理、病毒干擾和免疫組織化學(xué)等技術(shù)探討上述調(diào)控作用的具體途徑。
　　3.完美呈現(xiàn)小鼠大腦中膽堿能神經(jīng)元分布的高清三維圖像。
　　方法：
　　特異性抑制膽堿能神經(jīng)元對(duì)海馬齒狀回區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)目的調(diào)控作用：
　　為了特異性抑制小鼠大腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元，我們首先將實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的Kir2.1工具鼠（loxp-stop-loxp-Kir2.1-tdTomato）與在膽堿能神經(jīng)元中表達(dá)Cre重組酶的(C

7、hAT-Cre)轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，經(jīng)多次擴(kuò)增雜交和PCR鑒定后得到兩種轉(zhuǎn)基因小鼠（ChAT+/Kir2.1+，ChAT+/Kir2.1-）。將這兩種轉(zhuǎn)基因小鼠再分為注射他莫昔芬（Tamoxifen）組和注射玉米油（Oil）組，共計(jì)四組：
　　ChAT+/Kir2.1+/Tamoxifen，ChAT+/Kir2.1+/Oil，ChAT+/Kir2.1-/Tamoxifen，ChAT+/Kir2.1-/Oil。待Kir2.1充分表達(dá)后，

8、給各組小鼠腹腔注射Brdu。然后分別標(biāo)記在第1天（d）、4d、7d、14d、28d和42d時(shí)海馬齒狀回區(qū)（DG）的Brdu并計(jì)數(shù)。最后統(tǒng)計(jì)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間Brdu數(shù)量的差異。
　　特異性激活基底前腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元并觀察DG區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)目的恢復(fù)情況:
　　首先將ChAT+/Kir2.1+小鼠和ChR2小鼠雜交數(shù)代，得到兩種轉(zhuǎn)基因小鼠（ChAT+/Kir2.1+ChR2+，ChAT+/Kir2.1+ChR2-）。選取一些雄性

9、后代進(jìn)行Tamoxifen腹腔注射，然后在其基底前腦部埋置光纖。待Kir2.1和ChR2充分表達(dá)后，給各組小鼠腹腔注射Brdu。從14d開始對(duì)小鼠給予光激活處理（實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組：ChAT+/Kir2.1+ChR2+/給光組、ChAT+/Kir2.1+ChR2-/給光組），然后分別標(biāo)記28d和42d時(shí)DG區(qū)的Brdu并計(jì)數(shù)。最后統(tǒng)計(jì)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組間Brdu數(shù)量的差異。
　　觀察新生神經(jīng)元上膽堿能受體的表達(dá)情況：
　　選取一

10、批1月齡的雄性C57BL/6小鼠，在其DG區(qū)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV-GFP）。分別于4d、7d、14d、21d、28d和42d時(shí)結(jié)合膽堿能受體拮抗劑進(jìn)行電生理檢測(cè)，以及對(duì)受體類型進(jìn)行免疫組化標(biāo)記確證。
　　阻斷DG區(qū)新生神經(jīng)元上膽堿能受體對(duì)光激活模型小鼠中新生神經(jīng)元數(shù)目的影響：
　　基于上述光激活模型小鼠，通過(guò)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒特異性阻斷新生神經(jīng)元上膽堿能受體，標(biāo)記上述兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（28d和42d）的Brdu并計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

11、。
　　小鼠大腦中膽堿能神經(jīng)元分布的全腦三維重構(gòu)：
　　選取一只3月齡的雄性C57BL/6小鼠，對(duì)其腦組織進(jìn)行矢狀面的連續(xù)切片（16μm）。對(duì)所有矢狀面腦片進(jìn)行ChAT免疫組化染色，然后對(duì)腦片進(jìn)行二維的全腦掃圖。對(duì)所有拍攝好的大圖進(jìn)行角度和位置的校準(zhǔn)，最后將校準(zhǔn)好的圖片進(jìn)行三維合成，并導(dǎo)出相應(yīng)的圖片和視頻。此外，針對(duì)相關(guān)區(qū)域，首先用PhotoShop軟件在校準(zhǔn)好的圖片上進(jìn)行截圖，然后將這些裁剪出的圖片進(jìn)行三維合成并導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

12、
　　結(jié)果：
　　在觀察膽堿能神經(jīng)元對(duì)DG區(qū)新生神經(jīng)元調(diào)控的研究中，我們發(fā)現(xiàn)在膽堿能抑制組中，DG區(qū)Brdu的數(shù)目在1d、4d、7d和14d時(shí)和其它組間沒有明顯差異，而在28d和42d時(shí)則顯著降低。并且在給予光激活治療后，這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Brdu數(shù)目則趨向復(fù)原。
　　為了進(jìn)一步探討是哪種（或哪類）膽堿能受體參與了這種調(diào)控作用，我們發(fā)現(xiàn)第4d、7d的新生神經(jīng)元對(duì)ACh的刺激均沒有反應(yīng)，而在14d、21d和28d時(shí)對(duì)ACh的

13、刺激有反應(yīng)，且呈明顯的遞增趨勢(shì)，并且這種反應(yīng)只能被M型或M1型乙酰膽堿受體拮抗劑阻斷；同時(shí)，我們的免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示，只有14d、21d和28d時(shí)的新生神經(jīng)元能與M1受體共標(biāo)。隨后我們通過(guò)特異性阻斷新生神經(jīng)元上的M1型受體，發(fā)現(xiàn)上述光激活的治療作用明顯減弱。
　　我們首次應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建了小鼠大腦中膽堿能神經(jīng)元分布的三維圖像。在此三維圖像中，膽堿能神經(jīng)元分布的各個(gè)核團(tuán)清晰可見，其中:尾殼核（the caudate

14、putamen）中有約11000個(gè)膽堿能神經(jīng)元、基底前腦（the basal forebrain）中約12000個(gè)膽堿能神經(jīng)元、腦干腳橋核與腦干側(cè)被蓋核（the pedunculopontine nucleus and the laterodorsal tegmental nucleus）中約1200個(gè)膽堿能神經(jīng)元、腦干面神經(jīng)核（the facial nucleus of the brainstem）中約2200個(gè)膽堿能神經(jīng)元、腦干背運(yùn)