RFP13誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)控.pdf

1、細(xì)胞凋亡是所有多細(xì)胞生物自身調(diào)控的一種復(fù)雜的遺傳和生化過(guò)程。在胚胎發(fā)育，組織分化過(guò)程中起重要作用。細(xì)胞凋亡對(duì)成年組織保持正常細(xì)胞平衡，特別是哺乳動(dòng)物對(duì)各種生理和病理的死亡信號(hào)的反應(yīng)，如對(duì)感染源反應(yīng)的調(diào)節(jié)起到非常關(guān)鍵的作用。在凋亡主要通路中，獲得或失去關(guān)鍵基因的功能，能夠引起細(xì)胞內(nèi)平衡紊亂，甚至引起疾病。有證據(jù)顯示不充分的細(xì)胞凋亡，能夠引起癌癥的發(fā)生或自身免疫病如急性或慢性退行性疾病，免疫缺陷性疾病等。按細(xì)胞凋亡過(guò)程中是否有絲氨酸激酶(C

2、aspase)參與，一般可以分為Caspase依賴的和Caspase非依賴的細(xì)胞凋亡；按引起凋亡信號(hào)發(fā)生的先后順序可以分為上游和下游信號(hào)通路。一般將源于線粒體的凋亡信號(hào)如細(xì)胞色素C的釋放引起的Caspase的級(jí)聯(lián)放大稱為下游凋亡信號(hào)，將傳至線粒體的信號(hào)稱為上游凋亡信號(hào)。目前對(duì)于凋亡發(fā)生的下游通路已相當(dāng)清楚，但對(duì)于凋亡發(fā)生的上游信號(hào)還有待進(jìn)一步闡明。為了研究細(xì)胞凋亡調(diào)控，發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)功能基因鑒定程序用于Staurosp

3、orine(STS)和紫外線(UV)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。這一過(guò)程采用特定設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使其隨機(jī)插入細(xì)胞基因組，根據(jù)表型挑選克隆，鑒定被破壞基因。我們用這種方法在神經(jīng)元細(xì)胞(SH-Sy5y)中發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因RFP13。 細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)RFP13是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá)蛋白，RFP13的表達(dá)能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志之一是c-JunN端激酶JNK活性的增加，JNK在調(diào)節(jié)促凋亡信號(hào)通路中起到關(guān)鍵作用。其引起細(xì)

4、胞凋亡的信號(hào)處于線粒體的上游，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的上游信號(hào)。我們通過(guò)對(duì)RFP13全長(zhǎng)蛋白生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RFP13在N端(8-30aa)和中間(183-207aa)有兩段疏水內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜區(qū)，并通過(guò)構(gòu)建不同缺失突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)得到證實(shí)。對(duì)各缺失突變體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們誘導(dǎo)凋亡的能力依賴于ER定位和其C端，與各突變體激活JNK的能力相一致。 當(dāng)RFP13表達(dá)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)傳至下游的線粒體，引起線粒體外

5、膜通透性增高，導(dǎo)致下游凋亡促進(jìn)分子如細(xì)胞色素C的釋放，在核苷酸dATP/ATP的存在下，細(xì)胞色素C與Apaf-1多聚化形成凋亡體(Apoptosome)，然后Apaf-1通過(guò)CARD結(jié)構(gòu)域招募多個(gè)Caspase-9分子進(jìn)入復(fù)合物，Caspase-9自身發(fā)生構(gòu)象變化水解，從而引起下游的執(zhí)行Caspase，如Caspase-3的水解活化，Caspase-3活化后水解各種底物最終引起形態(tài)上可見(jiàn)的細(xì)胞凋亡，如細(xì)胞變圓、細(xì)胞核濃縮和破裂等。

6、 為了進(jìn)一步證明RFP13誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)位于線粒體的上游，我們用RNA干擾(RNAi)技術(shù)使RFP13表達(dá)沉默。針對(duì)RFP13cDNA序列設(shè)計(jì)選擇了一段19nt的核苷酸，并將其克隆到穩(wěn)定表達(dá)載體pSilencerTM2.1-U6Hygro.同時(shí)在19nt上引入2個(gè)點(diǎn)突變作為對(duì)照siRNA。將RFP13siRNA與RFP13-cMyc共轉(zhuǎn)染，Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RFP13siRNA能夠沉默RFP13的表達(dá)，并能抑制其引起的細(xì)胞凋亡