2型糖尿病聽(tīng)力損害機(jī)制與Cx26、Cx30關(guān)系的探討性研究.pdf

1、目的:糖尿病是一種由多種因素相互作用造成的以高血糖為主要特征的慢性代謝性疾病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口老齡化,其患病率逐年增高,其中,糖尿病確診病例中有90％為2型糖尿病,其慢性并發(fā)癥嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。1857年Jordao首次報(bào)道了糖尿病聽(tīng)力損傷,引起人們廣泛的關(guān)注,并進(jìn)行了大量的研究。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要從血管病變、神經(jīng)病變、代謝異常、遺傳基因?qū)W等方面對(duì)糖尿病聽(tīng)力損傷的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究,多數(shù)報(bào)道認(rèn)為由毛細(xì)胞損傷最終導(dǎo)致聽(tīng)力損害

2、,但導(dǎo)致毛細(xì)胞損傷的具體機(jī)制仍沒(méi)有明確。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接通道(Gap JunctionChannel,GJC)在耳蝸中為細(xì)胞間通信和物質(zhì)交流提供了橋梁作用,以保證內(nèi)淋巴液中的高K+濃度和內(nèi)淋巴液穩(wěn)態(tài),從而實(shí)現(xiàn)耳蝸的聲音信號(hào)傳導(dǎo)功能。耳蝸中構(gòu)成縫隙連接的連接蛋白(Connexin,Cx)主要為Cx26和Cx30,臨床上由兩者突變?cè)斐傻穆?tīng)力損失表現(xiàn)為進(jìn)行性高頻下降,這與糖尿病聽(tīng)力損傷的臨床表現(xiàn)相似;生理學(xué)上由兩者突變?cè)斐陕?tīng)力損失的機(jī)

3、制可能為兩者構(gòu)成的縫隙連接通道功能出現(xiàn)異常,從而影響內(nèi)淋巴液中K+濃度和內(nèi)淋巴液穩(wěn)態(tài),進(jìn)而使毛細(xì)胞變性,從而導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)異常。Cx26和Cx30在2型糖尿病大鼠耳蝸中表達(dá)情況如何以及與聽(tīng)力變化是否有關(guān),目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)在建立2型糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上,,通過(guò)測(cè)定糖尿病大鼠早期的聽(tīng)力學(xué)改變,采用耳蝸切片HE染色、免疫熒光組織化學(xué)染色觀察在不同時(shí)間正常大鼠和2型糖尿病大鼠耳蝸中Cx26和Cx30的變化,從分子

4、生物學(xué)水平探討Cx26和Cx30在2型糖尿病早期聽(tīng)力損傷發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用
　　 方法:選用健康、清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只,無(wú)噪音接觸史,耳廓反應(yīng)靈敏,體重180±20g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將其隨機(jī)分為對(duì)照組20只、實(shí)驗(yàn)組40只。對(duì)照組喂食常規(guī)飼料、實(shí)驗(yàn)組喂食高糖高脂飼料8周后兩組動(dòng)物全部禁食不禁水12小時(shí),對(duì)照組大鼠按30mg/Kg腹腔注射檸檬酸緩沖液,實(shí)驗(yàn)組大鼠按30mg/Kg腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozo

5、tocin,STZ)。于第9周末取大鼠尾靜脈全血測(cè)空腹血糖(Fasting blood glueose,FBG)＞7.8mmol/L且伴有胰島素抵抗為2型糖尿病動(dòng)物模型。期間記錄正常組、實(shí)驗(yàn)組造模前的體重,以及成模后第4周、8周、12周、16周、20周的體重、空腹血糖和尿糖;觀察各組大鼠活動(dòng)、攝食、尿量、尿味、全身毛發(fā),耳廓反應(yīng)的變化。兩組大鼠在造模前及造模成功后第4周、8周、12周、16周、20周分別接受聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)(auditory

6、 brainstem response,ABR)測(cè)試。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠在成模后第4周、8周、12周、16周、20周分別分批在全麻下進(jìn)行全身灌注、斷頭、取出耳蝸、固定、脫鈣,制作耳蝸石蠟切片進(jìn)行HE染色和免疫熒光組織化學(xué)染色觀察耳蝸形態(tài)變化和Cx26、Cx30在耳蝸內(nèi)表達(dá)變化。計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn),以P＜0.05為存在顯著性差異作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　

7、1一般觀察結(jié)果
　　 實(shí)驗(yàn)組大鼠表現(xiàn)為多食、多飲、多尿、尿膻味明顯,隨病情發(fā)展,逐漸出現(xiàn)全身毛失去光澤、脫毛、明顯消瘦、活動(dòng)減少、瘙癢等癥狀,耳廓反應(yīng)不靈敏。對(duì)照組大鼠外觀表現(xiàn)為正常,毛發(fā)光澤,無(wú)消瘦;耳廓反應(yīng)靈敏。
　　 2體重變化
　　 造模前和造模后4周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠體重?zé)o顯著性差異(P＞0.05.),造模后8周、12周、16周、20周實(shí)驗(yàn)組大鼠體重明顯低于對(duì)照組大鼠,兩組比較有顯著性差異(P＜0.01

8、)。
　　 3空腹血糖、尿糖變化
　　 造模后4周、8周、12周、16周、20周實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹血糖始終＞7.8mmol/L,對(duì)照組大鼠空腹血糖始終＜7.8mmol/L,兩組比較有顯著性差異(P＜0.01);造模后實(shí)驗(yàn)組大鼠尿糖始終為++++,對(duì)照組大鼠尿糖一直為±。
　　 4 ABR各項(xiàng)指標(biāo)變化
　　 實(shí)驗(yàn)期間,兩組動(dòng)物ABRⅡ波閾值比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。造模前實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠比較Ⅰ波

9、、Ⅲ波、Ⅴ波的潛伏期和Ⅰ-Ⅲ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波間期均沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);造模后4周實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠比較Ⅰ波、Ⅲ波、Ⅴ波的潛伏期和Ⅰ-Ⅲ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波間期仍沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);造模后8周、12周、16周、20周時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠和對(duì)照組大鼠比較Ⅲ波、Ⅴ波潛伏期和Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ波間期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),Ⅰ波潛伏期和Ⅲ-Ⅴ波間期沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5耳蝸石蠟切片HE染色
　　

10、 實(shí)驗(yàn)組大鼠耳蝸組織血管紋中管腔樣結(jié)構(gòu)與對(duì)照組耳蝸組織血管紋比較減少:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠耳蝸螺旋韌帶中和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組大鼠耳蝸螺旋韌帶中和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組。
　　 6耳蝸中Cx26、Cx30表達(dá)變化
　　 造模后4周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組耳蝸內(nèi)基底膜、血管紋和螺旋韌帶中Cx26、Cx30熒光表達(dá)強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);造模后8周、12周、16周、20周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)

11、照組耳蝸內(nèi)基底膜、血管紋和螺旋韌帶中Cx26、Cx30熒光表達(dá)強(qiáng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),且實(shí)驗(yàn)組耳蝸內(nèi)基底膜、血管紋和螺旋韌帶中Cx26、Cx30熒光表達(dá)強(qiáng)度弱于對(duì)照組。
　　 結(jié)論:
　　 1通過(guò)高糖高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射可以成功制備2型糖尿病大鼠模型,并可作為研究2型糖尿病聽(tīng)力損傷的動(dòng)物模型。
　　 22型糖尿病大鼠早期即存在聽(tīng)力損害,ABR可以作為其聽(tīng)力下降早期診斷的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。