小鼠冷凍胚胎和精子SNP遺傳鑒定方案的建立.pdf

1、動物小鼠已建立超過32000個品系，美國、歐洲和日本先后建立冷凍胚胎和精子保存庫代替?zhèn)鹘y(tǒng)連續(xù)繁殖方式，以保護小鼠這一重要遺傳資源，預防小鼠資源流失。美國杰克遜實驗室擁有世界上最豐富的小鼠資源和最大的冷凍胚胎、精子保存庫，我國也先后成立國家嚙齒類實驗動物種子中心和國家遺傳工程小鼠資源庫，并建立了大型低溫冷凍庫。低溫保存過程中，冷凍胚胎、精子遺傳特征的穩(wěn)定性是影響小鼠遺傳質量的重要影響因素之一，同時現(xiàn)代生物醫(yī)學研究已經離不開具有穩(wěn)定遺傳特性

2、的實驗小鼠。因此通過科研人員的努力，針對實驗小鼠個體的遺傳檢測方法已在不斷的建立、完善，但國內尚缺乏小鼠冷凍胚胎和精子的遺傳鑒定方案。主要是因為樣本有限且十分珍貴，相應的DNA量又遠低于常規(guī)個體。因此，研發(fā)針對特定區(qū)段、極微量的DNA前處理和DNA擴增方案，是建立冷凍胚胎和精子的遺傳鑒定檢測的首要任務。同時經過初步擴增的DNA樣本，可以進一步經DNA分子標記檢測，準確判斷其遺傳背景和品系。
　　方法：本研究以中科院上海實驗動物中心

3、（國家嚙齒類實驗動物種子中心上海分中心）提供的小鼠冷凍胚胎和精子為實驗樣本。小鼠胚胎的DNA采用直接裂解法，后利用全基因組擴增試劑盒獲得檢測所需要的大量DNA；精子DNA采用動物基因組DNA快速抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）進行抽提。抽提的DNA采用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提DNA的量。
　　抽提的DNA經四組多重PCR擴增，以PCR產物為模版進行多重高溫連接酶的連接檢測反應（ligase detection react

4、ion，LDR），LDR產物采用標準6%變性測序PAGE膠進行電泳分析。最后使用 GeneTM672來收集數據并用Genemapper進行基因分型。該PCR-LDR檢測技術選取了小鼠21條染色體上的45個SNP位點，分成4組，每組分別為12、11、10、12個SNP位點。針對這些位點分別設計引物和探針，實現(xiàn)SNP基因分型。
　　結果：改進的小鼠冷凍胚胎、精子DNA提取方案，采用顯微挑取法獲取正常2細胞期胚胎，并以200 mmol/

5、L KOH、50 mmol/L二硫蘇糖醇的裂解液（PH8.3）來獲取胚胎微量DNA；精子DNA通過添加DTT和蛋白酶K消化6 h的抽提試劑盒抽提獲得。此方案能夠高效地獲取胚胎和精子DNA。
　　通過全基因組擴增試劑盒實現(xiàn)小鼠胚胎微量 DNA擴增方案，從擴增和檢測結果看出，胚胎2細胞期細胞量≥12個最佳。
　　PCR-LDR分型方案適用于小鼠45個SNPs的分型。該方案以FVB小鼠為驗證樣本，分型的45個SNPs位點基因型與N

6、CBI數據庫中的信息完全一致；并且以rs13477094位點為例，經測序驗證后，分型結果與其一致。
　　通過以上這些方案結果，本研究成功地將小鼠冷凍胚胎和精子 SNPs分型方案應用于12種品系小鼠冷凍胚胎和精子的遺傳背景鑒定。結果顯示45個SNP位點全部檢測出的概率高達95%以上。其中小鼠胚胎NOD、DBA1品系有1個SNP點未檢出， EG、Scid品系有2個點未檢出，BALB/c、ACA品系有4個點與NCBI數據庫中信息不符；1

7、2個品系間兩兩進行位點差異比較，最大差異點個數為30個，最小差異點個數為8個，平均差異位點個數為19個。小鼠精子中NOD、B10A品系有1個SNP點未檢出，NOD-Scid、Scid-BG品系有2個點未檢出，C3H-Scid, C3H/ORL品系有3個點與NCBI數據庫中信息不符；12個品系間兩兩進行位點差異比較，最大差異點個數為29個，最小差異點個數為7個，平均差異位點個數為18個。由此可見45個SNP位點在檢測小鼠冷凍胚胎和精子品系