胎盤羊膜包裹脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合BDNF和CNTF轉(zhuǎn)染BMSCs纖維蛋白膠橋接的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷后的再生與修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要課題。在神經(jīng)再生中BDNF和CNTF非常重要，局部微環(huán)境中的神經(jīng)生長因子的濃度差對近端生長錐的誘導(dǎo)作用是重要機(jī)制之一，在基因分子生物學(xué)和組織工程方面促進(jìn)神經(jīng)的再生將是非常有前景的研究方向。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，近年發(fā)現(xiàn)其可以經(jīng)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，具有潛在的修復(fù)神經(jīng)損傷的能力。本實(shí)驗(yàn)我們使用醫(yī)用膠涂抹固定的方法，把胎盤羊膜包裹脫細(xì)胞同種異體

2、神經(jīng)復(fù)合BDNF和CNTF轉(zhuǎn)染BMSCs纖維蛋白膠的移植技術(shù)應(yīng)用于修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)，并對其機(jī)制做了初步探討，以期為明確其修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制和進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)共分為四部分:
　　 第一部分:大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 第二部分:BDNF和CNTF表達(dá)載體構(gòu)建及在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)
　　 第三部分:脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)和胎盤羊膜的制備
　　 第四部分:胎盤羊膜包裹脫

3、細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合BDNF和CNTF轉(zhuǎn)染BMSCs纖維蛋白膠橋接的實(shí)驗(yàn)研究
　　 第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：研究間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)并鑒定。
　　 方法：采用貼壁法在體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，相差顯微鏡觀察原代和傳代細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的BMSCs為貼壁生長的成纖維樣細(xì)胞，傳代后的細(xì)胞均一性好。
　　 結(jié)論：間充質(zhì)干細(xì)

4、胞有很強(qiáng)的增殖能力，而且容易獲取和培養(yǎng)。
　　 第二部分：BDNF基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立及體外表達(dá)
　　 目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMsCs)易于分離擴(kuò)增，具備多方向分化潛能，免疫源性低，可自體移植，并且有良好遷移性，預(yù)示其在基因治療中可能成為有價值的運(yùn)載細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)利用載體介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary N

5、eurotrophic Faetor，CNTF)轉(zhuǎn)染MSCS，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染特性和體外表達(dá)情況，建立基因工程細(xì)胞，為進(jìn)一步體內(nèi)研究提供基因工程細(xì)胞來源。
　　 方法：取大鼠的骨髓進(jìn)行MSCS的分離、培養(yǎng)和流式細(xì)胞儀鑒定。選擇較好的方法介導(dǎo)PcDNA3.1（-）-BDNF和CNTF轉(zhuǎn)染MSCs并經(jīng)優(yōu)化濃度的G418篩選建立基因工程細(xì)胞，用免疫組化檢測BDN下基因表達(dá)情況，RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證目的基因表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：

6、成功培養(yǎng)BMSCs，流式細(xì)胞鑒定顯示各細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)率分別為CD44:93.25％、CD34:4.63％、CD45:8.01％。轉(zhuǎn)染成功擴(kuò)大培養(yǎng)并建立工程細(xì)胞(BDNF和CNTF-MSCS)，免疫組化顯示BDNF和CNTF陽性表達(dá)率達(dá)90％，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳證實(shí)目的基因陽性條帶。
　　 結(jié)論：成功建立BDNF和CNTF基因修飾MSCS的工程細(xì)胞，并用免疫組化和RT-PCR方法證實(shí)了工程細(xì)胞具備體外表達(dá)目的基因功能。

7、r>　　 第三部分：脫細(xì)胞異體神經(jīng)和胎盤羊膜的制備
　　 目的:制備脫細(xì)胞異體神經(jīng)和胎盤羊膜.
　　 方法:將用Sondell法(TritonX-100、脫氧膽酸鈉)和改良法[TritonX-200，sulfobetaine-10(SB-10)，sulfobetaine-16(SB-16)]兩種方法制備的去細(xì)胞異體神經(jīng)及參考陳有剛、朱家愷方法制備胎盤羊膜，用HE染色、髓鞘染色、免疫組化染色等進(jìn)行組織學(xué)評價。
　　

8、 結(jié)果:改良法制備的神經(jīng)及胎盤羊膜髓鞘及細(xì)胞去除徹底、結(jié)構(gòu)保存完整。
　　 結(jié)論:綜合運(yùn)用萃取劑TritonX-200，SB-10和SB-16的改良化學(xué)萃取方法是一種較為理想的去細(xì)胞異體神經(jīng)制備方法，其制備的異體神經(jīng)移植物可望替代自體神經(jīng)移植。胎盤羊膜達(dá)到要求。
　　 第四部分：胎盤羊膜包裹脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)復(fù)合BDNF和CNTF轉(zhuǎn)染BMSCs纖維蛋白膠橋接的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:將胎盤羊膜包裹脫細(xì)胞同種異體神

9、經(jīng)復(fù)合BDNF和CNTF轉(zhuǎn)染BMSCs纖維蛋白膠的移植技術(shù)應(yīng)用于修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)，并對其機(jī)制做了初步探討，以期為明確其修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的機(jī)制和進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:取35只SD大鼠，10％水合氯醛注射(0.4mL/100g)麻醉，麻醉持續(xù)時間2～2.5小時。無菌條件下暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，切除7mm坐骨神經(jīng)，一般在梨狀肌下緣3mm處切除，任坐骨神經(jīng)自然回縮，這樣就做成了10mm坐骨神經(jīng)缺損模型。將大鼠隨

10、機(jī)分組為A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組(n=5):
　　 A組，CEANA移植組，采用10mmCEANA端端吻合缺損的坐骨神經(jīng)，坐骨神經(jīng)缺損后，移植段周圍微量注射器注射0.1mL生物蛋白膠;
　　 B組，BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠復(fù)合CEANA組，采用CEANA端端吻合缺損的坐骨神經(jīng)，在移植神經(jīng)段周圍注入濃度為33mg/L的BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠復(fù)合物0.1mL;
　　

11、C組，胎盤羊膜包裹BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠復(fù)合CEANA組，神經(jīng)兩斷端間就能分化為間距約4mm的神經(jīng)再生室。手術(shù)時隨機(jī)向再生室內(nèi)注入濃度為33mg/L的BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠0.1mL。為了避免營養(yǎng)因子滲出，注射以后，將處理過的人胎盤羊膜基質(zhì)膜包裹套和CEANA段銜接。
　　 D組，胎盤羊膜包裹BDNF/BMSCs生物蛋白膠復(fù)合CEANA組，采用CEANA端端吻合缺損的坐骨神經(jīng)，在移植神經(jīng)段周圍

12、注射生BDNF/BMSCs生物蛋白膠復(fù)合物0.1mL;
　　 E組，胎盤羊膜包裹CNTF/BMSCs生物蛋白膠復(fù)合CEANA組，采用CEANA端端吻合缺損的坐骨神經(jīng)，在移植神經(jīng)段周圍注射生CNTF/BMSCs生物蛋白膠復(fù)合物0.1mL;
　　 F組，胎盤羊膜包裹BMSCs生物蛋白膠復(fù)合CEANA組，采用10mmCEANA端端吻合坐骨神經(jīng)缺損后，移植段周圍微量注射器注射0.1mLBMSCs生物蛋白膠復(fù)合物;
　　

13、G組，胎盤羊膜包裹生物蛋白膠復(fù)合CEANA組，采用10mmCEANA端端吻合坐骨神經(jīng)缺損后，移植段周圍微量注射器注射0.1mL生物蛋白膠;
　　 各組小鼠分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物坐骨神經(jīng)未損傷側(cè)（左側(cè)）切開暴露坐骨神經(jīng)，作為正常對照組。
　　 術(shù)后行大體觀察;術(shù)前及術(shù)后2、4、6、8周測量小鼠坐骨神經(jīng)指數(shù)(static sciatic index，SSI);術(shù)后8周取材計算術(shù)側(cè)小腿三頭肌濕重恢復(fù)率并行小腿三頭肌Masson染色

14、觀察，吻合口遠(yuǎn)端神經(jīng)行甲苯胺藍(lán)染色。
　　 結(jié)果：術(shù)后各組動物切口愈合良好。各組SSI隨時間延長逐漸增加，術(shù)后4、6、8周C組SSI均高于A、G組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);C組略高于D、E、F組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后8周，D、E、F組小腿三頭肌濕重恢復(fù)率、有髓神經(jīng)纖維總數(shù)均優(yōu)于A、G組，但較C組差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);C組小腿三頭肌纖維面積、髓鞘厚度均優(yōu)于A、G組(P＜0.O1)，而與