用于藥物安全性評價的斑馬魚生物技術(shù)平臺建設(shè)研究.pdf

1、第一部分斑馬魚普通實驗室養(yǎng)殖體系的建立
　　 目的：建立普通實驗室條件下的斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，通過日常飼養(yǎng)和胚胎繁育初步掌握斑馬魚生物學特性，為今后建立斑馬魚用于藥物安全評價的實驗平臺奠定基礎(chǔ)。方法：利用魚缸、潛水泵、溫控棒、過濾器等建立普通斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，并用配對產(chǎn)卵和人工受精的方法獲得斑馬魚胚胎。結(jié)果：建立起了普通實驗室斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，并成功繁育斑馬魚。結(jié)論：建立的普通實驗室斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)具有廉價、簡便、穩(wěn)定、可操作性強等優(yōu)點，

2、為建立斑馬魚用于藥物安全評價的實驗平臺奠定了基礎(chǔ)，可用于前期一般研究。
　　 第二部分斑馬魚胚胎發(fā)育特征及適宜的毒理學終點分析
　　 目的：觀察斑馬魚胚胎發(fā)育的全過程，分析可用于胚胎毒性試驗的適宜的毒理學指標。方法：選取健康的性成熟斑馬魚雌雄配對產(chǎn)卵，用體式顯微鏡對胚胎發(fā)育過程進行系統(tǒng)的形態(tài)學觀察，并拍攝整個過程。結(jié)果：斑馬魚胚胎發(fā)育可以大致分成受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、咽部期和孵化期等7個時期；建議了

3、一些在胚胎毒性研究中適宜的毒理學觀察終點。結(jié)論：初步掌握了斑馬魚的胚胎發(fā)育過程以及各時期發(fā)育的形態(tài)學特征，確立的部分毒理學終點具有實際可行性。
　　 第三部分秋水仙堿對斑馬魚肝臟和鰓SOD和Na+-K+-ATPase活性及組織結(jié)構(gòu)的影響
　　 目的：研究不同濃度的秋水仙堿對斑馬魚肝臟和鰓組織SOD和Na+-K+-ATPase活性及組織結(jié)構(gòu)的影響，探索以斑馬魚的某些酶類活性和組織結(jié)構(gòu)變化作為觀測指標進行藥物安全性評價的試驗

4、方法，為建立用于藥物安全評價的斑馬魚實驗平臺奠定基礎(chǔ)。方法：在預實驗的基礎(chǔ)上將斑馬魚暴露于秋水仙堿5個濃度組中進行96h急性毒性試驗，計算其半數(shù)致死濃度(LC50)。此外，設(shè)置3個濃度(0.67、1.70、4.26mg·L-1)，進行21d慢性毒性實驗，期間每7天測定斑馬魚的肝臟和鰓中的SOD和Na+-K+-ATPase活性。21d染毒結(jié)束，取各組斑馬魚鰓和肝臟組織進行HE染色，觀察秋水仙堿染毒對其結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：秋水仙堿對斑馬魚的L

5、C50為16.90mg·L-1。隨秋水仙堿濃度增大和染毒時間延長，斑馬魚鰓中SOD和Na+-K+-ATPase活性均顯著受到抑制；肝臟SOD活性增加，Na+-K+-ATPase活性總體呈現(xiàn)抑制趨勢。病理切片結(jié)果顯示秋水仙堿對斑馬魚鰓和肝臟組織有不同程度的損害。結(jié)論：斑馬魚肝臟和鰓的SOD及Na+-K+-ATPase對秋水仙堿敏感，可作為觀測指標用于評價藥物的毒性。
　　 第四部分秋水仙堿對斑馬魚胚胎發(fā)育中tnf-α和sod-1基

6、因表達的影響
　　 目的：研究不同濃度秋水仙堿對斑馬魚胚胎發(fā)育中tnf-α和sod-1基因表達的影響，探索以斑馬魚胚胎為實驗對象，以目的基因的mRNA相對含量為指標的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測方法。方法：用不同濃度的秋水仙堿(0mg·L-1、10mg·L-1和40mg·L-1)處理斑馬魚胚胎，收集受精后24h、48h和72h的斑馬魚胚胎，用RT-PCR方法觀察tnf-α和sod-1基因在不同時期斑馬魚胚胎中的表達情況

7、。結(jié)果：在試驗時間內(nèi)，與對照組相比，各藥物處理組的斑馬魚胚胎tnf-α基因表達均受到抑制，并呈現(xiàn)濃度-效應關(guān)系；斑馬魚胚胎sod-1基因在較低濃度組(10mg·L-1)表達上調(diào)，而較高濃度組(40mg·L-1)則抑制其表達。結(jié)論：研究了不同濃度秋水仙堿對斑馬魚胚胎發(fā)育中tnf-α和sod-1基因表達的影響，初步建立了以斑馬魚胚胎為實驗對象，以目的基因的相對含量為觀測指標的RT-PCR檢測方法，為建立用于藥物安全性評價的斑馬魚生物體系平臺