高甘油三酯血癥大鼠主動脈高血凝相關(guān)新基因的篩選、鑒定和克隆.pdf

1、該研究在我室建立的高血凝大鼠動物模型的基礎(chǔ)上,采用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)技術(shù),篩選、鑒定和克隆大鼠主動脈高血凝相關(guān)新基因.首先我們用高淀粉膳食(糖占總熱量80﹪)造成內(nèi)源性高甘油三酯血癥(HTG)的大鼠模型,并對其凝血活性和纖溶活性進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)HTG大鼠的凝血活性增加而纖溶活性降低,即血液處于高凝狀態(tài).這表明用高淀粉膳食成功建立了高血凝大鼠動物模型.抑制性消

2、減雜交(SSH)需要0.5~2ug的mRNA,由于大鼠主動脈組織中總RNA含量低,不足以獲得足夠量的mRNA以合成dscDNA,因此,我們利用SMART技術(shù)從總RNA合成dscDNA.然后,利用SSH dscDNA進(jìn)行抑制性消減雜交,并將消減產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,成功構(gòu)建了大鼠主動脈高血凝消減文庫.經(jīng)鑒定該文庫的消減效率高,為進(jìn)一步篩選和克隆高血凝相關(guān)新基因奠定了良好的基礎(chǔ).所構(gòu)建的消減文庫擴(kuò)增后包含約1

3、000個白色克隆.根據(jù)HC002 EST(567bp)序列,設(shè)計基因特異性引物(GSP1和GSP2)和巢式引物(NGSP1和NGSP2),通過SMART RACE技術(shù)分別擴(kuò)增其5'端和3'端,成功地得到了約為500bp的5'-RACE PCR產(chǎn)物和約為800bp的3'-RACE PCR產(chǎn)物.將5'-RACE和3'-RACE產(chǎn)物克隆并測序,測序結(jié)果與EST序列用軟件Contig 1拼接成一條1275bp的完整序列,即HCR2基因的全長cD